瓜类褪绿黄化病毒及其系统进化分析

韩 盛，麦麦提艾力·阿卜杜纳斯尔，杨 渡，温且木·阿布列孜，玉山江·麦麦提

(1.新疆农业科学院植物保护研究所/农业部西北荒漠绿洲作物有害生物综合治理重点实验室，乌鲁木齐 830091；2.阿勒泰市菜篮子工程办公室，新疆阿勒泰 836500)

0 引 言

【研究意义】瓜类褪绿黄化病毒(Cucurbitchloroticyellowsvirus, CCYV)属长线形病毒科(Closteroviridae)毛形病毒属(Crinivirus)[1]。CCYV主要侵染甜瓜、黄瓜、西瓜等作物[1, 2]，引起叶片褪绿和黄化，但叶脉仍然保持绿色，严重时整株叶片变黄，已经成为制约瓜类作物产量和品质的重要病毒。【前人研究进展】于2004年，CCYV最早发现于日本的甜瓜上，至今已在中国[2, 3]、苏丹[4]、黎巴嫩[5]、伊朗[6]、希腊[7]、埃及[8]、沙特阿拉伯[9]等国家发现。2011年，中国上海市、浙江省、山东省陆续发现CCYV，之后在中国河南、海南[10]、新疆[11]、湖南[12]、广西[13]等省(自治区)也发现该病毒。该病毒主要由B型和Q型烟粉虱(Bemisia tabaci Biotype B和Q)以半持久性方式传播，Q型传毒效率高于B型[14-16]。CCYV在瓜类作物上的发生与传播媒介烟粉虱的群体种类和数量存在密切关系[14]。新疆大部分地区都发现烟粉虱，存在发生CCYV的风险[17]。2016年，中国新疆吐鲁番大田复播甜瓜报道CCYV的发生，并且不断扩散蔓延[18]。【本研究切入点】近几年在我国新疆南疆甜瓜主产区甜瓜叶片黄化症状比较常见，但对新疆南疆甜瓜CCYV的发生与分布，未见报道。研究南疆甜瓜产区CCYV的分布、分子变异以及进化。【拟解决的关键问题】研究从中国新疆洛浦县、疏勒县、疏附县、巴楚县、阿克苏市、莎车县、伽师县甜瓜田间采集黄化症状的51份叶片样品，通过RT-PCR检测CCYV的特异性片段，并克隆序列后进行核酸和系统分析。

1 材料与方法

1.1 材 料

在2019年随机收集中国新疆洛浦县、疏勒县、疏附县、巴楚县、阿克苏市、莎车县、伽师县的具有黄化症状甜瓜叶片样品，保存至-80℃冰箱备用。

1.2 方 法

1.2.1 CCYV的RT-PCR

将总RNA根据制造商的说明书(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，北京)反转录为cDNA。以cDNA为模板进行CCYV的RT-PCR检测，正向引物为5′-GAGGATGGAGCCGAGTTAT-3′，反向引物为5′-GTGCCAACTGAGACACGTTA-3′。PCR反应体系：2×easyTaqsuper Mix 10 μL、正反引物各0.4 μL(10 μmol/L)、cDNA 1 μL、ddH2O补足至20 μL。PCR仪程序包括：95℃预变性5 min，35个循环，每个循环94℃变性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸40 s，最终72℃总延伸10 min，将PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.2 克隆测序

以洛浦县采集疑似病毒病的样品cDNA为模板做PCR，将PCR产物参照柱式DNA切胶回收试剂盒(全式金生物技术有限公司，北京)说明书进行回收，将回收产物与pMD18-T克隆载体连接，并转化至大肠杆菌DH5α，菌液PCR鉴定的3个阳性单克隆送至公司进行测序(华大基因公司)。

1.2.3 序列分析和系统发育树

将测序得到的核酸序列在NCBI上进行BLAST比对，并下载相似性较高的序列。将之前在文献报道的序列作为分类标准，以莴苣褪绿病毒(Lettucechlorosisvirus, LCV)的基因作为外群[19]，系统进化树采用MEGA5.0软件中的邻接法(Neighbor-joining method)进行5 000次Bootstrap重复计算。

2 结果与分析

2.1 CCYV感染洛浦县甜瓜的症状

研究表明，中国新疆南疆甜瓜叶片具有明显的黄化现象，叶片叶肉开始退绿，而后黄化，向上发展，逐渐黄化，严重时整株黄化，但叶脉仍为绿色。大棚里甜瓜被CCYV感染的典型特征。图1

注：A和B：大棚里的甜瓜被CCYV感染的早期症状；C：大棚里的甜瓜被CCYV感染的中期症状；D：大棚里的甜瓜被CCYV感染的晚期症状

2.2 RT-PCR检测CCYV

研究表明，51份甜瓜样品中，只有洛浦县样品中可以看到预期大小相符的条带，洛浦县的13份样本中，8份检出为CCYV阳性，检出率为61.53%，而中国新疆巴楚县、阿克苏市、莎车县、伽师县、疏勒县、疏附县未检出CCYV。图2

注：泳道M：2 000的DNA marker；泳道-：阴性对照；泳道1～23：51份样本的一部分，其中泳道15-23表示洛浦县的部分样本

2.3 洛浦县CCYV分离物核酸序列

研究表明，以中国新疆洛浦县阳性样本的cDNA为模板PCR扩增、克隆测序后，获得了685 bp的核酸序列。与CCYV分离物的CP基因的最高一致性(identity)为100%，即与来自日本(YP_006522431.1)、黎巴嫩(AGT56730.1、AGT56731.1、AGT56734.1)和QDQ37124.1的CCYV分离物CP基因的一致性均为100%，中国新疆洛浦县的该病毒为CCYV。表1

表1 与GenBank一致性较高的部分CCYV序列

2.4 洛浦县CCYV分离物的进化

研究表明，所有分离物分类成3个组(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)。在Bootstrap值很高(98)的水平上，研究所得中国新疆洛浦县CCYV分离物的CP基因与1个苏丹分离物(JF807053)、3 个日本分离物(AB523789、NC018174、XP-006522431)、3个塞浦路斯分离物(LT992909、LT992910、LT992911)、9个黎巴嫩分离物(KC990504、JX014262、KC990505、KC990506、KC990507、KC990508、KC990503、AGT56730、AGT56731)和11个国内分离物(KJ735450、HM581658、KX118632、KP896506、JF502222、KY400632、KY400633、KY400634、JQ904629、KU507602、KJ149806)的CP基因聚在I组(Group I)，进行分析的分离物来源是不同国家，但具有很高遗传距离，且不同地区遗传差异很小。在Bootstrap值99的水平上，沙特阿拉伯的8个分离物(ALN96446, KT946811、KT946809、KT946816、KX120124、KX120123、KX120122、KX120121)聚在Ⅱ组。在Bootstrap值99的水平上，伊朗的3个分离物(KC577203、KC577202、KC577201)聚在Ⅲ组。中国新疆洛浦县分离物在进化上与其他地区的分离物存在较高亲缘性，变异很小。图3

注：系统进化树运用MEGA5.0软件的邻接法(Neighbor-joining method)构建，Bootstrap值是5 000次重复；●表示研究测序所得到的序列

3 讨 论

CCYV主要由B型和Q型烟粉虱以半持久性方式传播[14-16]。CCYV在瓜类作物上的发生与传播媒介烟粉虱的群体种类和数量存在密切关系[14]，2011年报道Q型烟粉虱侵入中国新疆[20]之后，2013年在中国新疆石河子市、博乐市、岳普县、泽普县、叶城县、莎车县、墨玉县、和田市、阿克苏市、哈密市、鄯善县、乌鲁木齐市、克拉玛依市、伊宁市、吐鲁番市和库尔勒市等地发现烟粉虱[17]。2016年报道吐鲁番发现CCYV侵害哈密瓜[18]，但南疆瓜区未见报道。研究发现2019年在中国新疆南疆甜瓜种植区晚熟瓜和复播甜瓜上发生叶片黄化症状，研究只对南疆7个县/市具有黄化症状的甜瓜叶片进行CCYV病毒的检测，发现只有洛浦县检测到CCYV，且检测率达到59.57%，但该病毒在和田、喀什和阿克苏地区的其它县没有发现待进一步深入的研究。研究测序得到的洛浦县CCYV序列与GenBank上的甜瓜CCYV分离物的CP基因的一致性达到100%，2019年在洛浦县甜瓜种植区叶片上发生大面积导致黄化症病毒是CCYV，CCYV在洛浦县甜瓜区普遍发生。在中国新疆甜瓜主产区需要对烟粉虱进行监测和控制，有效防治CCYV。

CCYV基因组结构2010年才被揭示[1]，2016年，彭斌等[11]报道在中国新疆吐鲁番发现CCYV，且获得其分离物的全基因组序列，分析的分子变异和系统进化结果表明，中国吐鲁番CCYV分离物与中国其他省以及周围国家的CCYV分离物聚为同一组，CCYV的分子变异很低[11]。研究中，基于CP基因序列构建的系统发育树表明，中国新疆洛浦县CCYV分离物与中国新疆(吐鲁番)、苏丹、日本、塞浦路斯、黎巴嫩、聚在同一组中国的CP基因，这些地区虽然存在一定的地理分化，但遗传变异很低，结果与彭斌等[11]研究新疆吐鲁番CCYV的结果一致，可能属于同一来源，病毒初始来源单一，也可能是遗传变异低的原因之一。

4 结 论

从中国新疆巴楚县、阿克苏市、莎车县、伽师县、疏勒县、疏附县采集的疑似甜瓜病毒病的样本中均未发现CCYV，只在中国新疆洛浦县发现CCYV，在洛浦县的检测率达到59.57%，且对洛浦县甜瓜生产造成危害。中国新疆洛浦县分离物与中国其他省区、日本、黎巴嫩、黎巴嫩、沙特阿拉伯、黎巴嫩等地区的CCYV分离物具有很高一致性，CCYV中国新疆洛浦县分离物与来自中国其它省和我国周围国家分离物亲缘关系很近，且变异很低。