花生红衣中原花青素的提取工艺与活性研究

吕 筱，郑天元，韦新月，窦子珊，代紫，高晨佳，蔡 冉，孟琬星，王汝华，3

（1.天津科技大学食品科学与工程学院，天津 300457；2.通标标准技术服务（天津）有限公司，天津 300457；3.天津科技大学食品科学国家级实验教学示范中心，天津 300457）

0 引言

花生（Arachis hypogaeaL.）属豆科（Leguminosae sp.）落花生属植物，又称长果、泥豆等，是使用广泛的一种坚果，在我国山东省和河南省生长最佳[1]。花生红衣是花生的种皮，因绝大多数花生品种的种皮为红色而得名。原花青素是其主要活性成分之一，具有抗氧化、抗肿瘤、抑菌抗炎和免疫调节等多种活性功能[2-3]。原花青素广泛存在于植物的果皮、种子、花和叶片中，是一大类天然多酚化合物的总称[4]。由于其无毒且安全性较好，具有很强的抗氧化活性，可以有效清除人体内的自由基，从而可以起到抗衰老、保护心脑血管等效果，因此可应用于功能性食品等多种领域。原花青素具有多个酚羟基，可以在人体内释放H+，与自由基竞争性地结合，终止自由基链式反应，从而避免脂质氧化分解。Ariga T[5]的研究表明，原花色素的抗氧化活性在水性体系中比维C或维E强得多，且纯度越高抗氧化能力越强。超声波法提取广泛应用于天然产物及生物活性物质提取等领域[6-9]，是最常见的原花青素提取方式[10-12]。试验的目的是立足于有机溶剂浸提法，对花生红衣的提取工艺进行优化，并且探究原花青素的抗氧化功能，旨在降低成本、提高得率，为花生红衣的综合利用和深加工提供了新途径，实现资源高效率利用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

花生红衣，乳山市金果花生制品有限公司提供，原料产地山东烟台。

石油醚、无水乙醇、甲醇、盐酸、硫酸亚铁、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠等，天津市化学试剂一厂提供；香兰素、水杨酸、维C、没食子酸、原花青素标准品、Tris-HCl等，北京索莱宝科技有限公司提供。

1.2 仪器与设备

UV-3200型紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司产品；5418 R型微型冷冻离心机，艾本德中国有限公司产品；FC型全波长酶标仪，赛默飞世尔科技有限公司产品；IKA RV8型旋转蒸发仪，艾卡仪器设备有限公司产品；FE20型酸度计、ML104型电子天平，梅特勒托利多仪器（上海）有限公司产品；BILON6-180B型超声波清洗器，上海比郎仪器制造有限公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 花生红衣原花青素的提取

取花生红衣，使用摇摆式粉碎机将花生红衣粉碎，并将花生红衣粉用80目标准分样筛过筛，取筛分后花生红衣粉，称质量，按料液比1∶15（g∶mL）加入石油醚，于30℃振荡恒温水槽中脱脂5 h，抽滤，脱脂后的花生红衣置于通风橱中自然风干，称重后于4℃冰箱中冷藏密封保存备用。

1.3.2 花生红衣原花青素含量测定

采用香草醛-盐酸法测定原花青素含量[13]。以葡萄籽原花青素标准溶液（0.1～0.5 mg/mL）为标品绘制标准曲线（Y=6.774X+0.028 2，R2=0.998 5），测量样品于波长500 nm处吸光度。花生红衣样品中的原花青素含量表示为毫克葡萄籽原花青素当量每克干原料（mg PC/g DM）。

1.3.3 花生红衣原花青素提取的工艺优化正交试验

根据单因素试验（图1）的结果，选取提取时间（A）、提取温度（B）、料液比（C）、乙醇体积分数（D）4个因素在3个水平上设计正交试验。其他条件为超声功率100 W，提取次数3次，测定各组试验中粗提物的原花青素含量，计算得率后分析结果，得到最优提取工艺。

1.3.4 花生红衣粗提物的纯化

在最佳提取工艺条件下获得的原花青素粗提物进行旋蒸除净乙醇。称取5 g新的AB-8型大孔吸附树脂进行干燥处理，并浸泡在95%的乙醇溶液中2～4 h。蒸馏水洗去乙醇后湿法装柱（1 cm×10 cm层析柱），再用2倍体积蒸馏水洗柱床。取20 mL粗提物上样，静置一段时间等待吸附饱和，再用2倍体积蒸馏水洗柱床，然后使用60%乙醇洗脱。收集流出液，观察颜色规律。洗脱液旋转除净乙醇，冻干，得到原花青素纯化干物质。测定所得纯化干物质质量，取0.01 mg样品，溶于1 mL甲醇后，按香草醛-盐酸法测定原花青素含量，得到样品纯度。

1.3.5 体外抗氧化活性的测定

参照浦娜娜[14]的方法测定花生红衣样品的总还原力。对DPPH自由基的清除试验参考Kamiloglu S等人[15]的方法并稍作修改。超氧阴离子自由基清除能力的测定参考Mathew S等人[16]的方法并稍作修改。清除羟自由基的测定参考Goncalves S等人[17]的方法并稍作修改。

1.3.6 数据处理

每个试验均重复3次，试验数据以平均值±标准偏差表示。使用Microsoft excel 2010和Origin 9.0对结果进行处理，并对数据进行单向方差分析（ANOVA），并用SPSS 17.0通过Duncan的多范围测试计算样本平均值之间差异的显着性，p＜0.05表示差异。

2 结果与分析

2.1 原花青素提取单因素试验

不同因素对花生红衣原花青素提取率的影响见图1。

图1 不同因素对花生红衣原花青素提取率的影响

由图1（a）可知，原花青素得率随着时间变化呈现先增大后降低的趋势，并在超声提取时间20 min时，达到最大值6.63%±0.77%。这是由于超声时间越长，原花青素的溶解量就越多，提取率也会随之升高，而提取时间过长，会导致导致花生红衣的纤维素网络结构松散，将原花青素限制在内部，导致得率下降[18]。由图1（b）可知，原花青素得率随着温度升高呈现先增大后降低的趋势，并在提取温度30℃时，达到最大值6.05%±0.34%。随着温度增高导致细胞脱水，细胞结构发生变化，分子运动的速度加快，从而导致溶出的速度变快，原花青素得率升高[19]。然而，随着温度的进一步增高，会加速原花青素氧化的进程，同时杂质也会增加，影响后续的纯化过程，并且高温会加速提取溶剂的挥发，影响提取效果同时造成浪费。由图1（c）可知，原花青素得率呈现出先增大后降低的趋势，并且在料液比1∶16（g∶mL）时，达到最大值6.97%±0.76%。这是由于溶剂的用量增大，提取率也会随之有较明显的升高，原花青素的率达到最大之后降低，出现这种现象可能的原因是在一定量的提取剂中，原花青素已经基本溶出，如果仍继续加大提取剂的用量，不仅会造成提取剂的浪费并增加成本，还反而会因为提取剂使用过量，使超声波的能量传递及空化效应减弱，从而使原花青素得率降低[20-21]。在使用低体积分数乙醇作为提取剂时，出现了难以抽滤的情况，可能的原因是体积分数低于50%的乙醇溶液可提取出某些分子量较大的物质，造成抽滤困难，因此提取剂浓度不能过低。由图1（d）可知，原花青素得率呈现出先增大后降低的趋势，并且在体积分数为70%时，达到最大值5.29%±1.45%。这可能是因为水的极性较大，乙醇的极性较小，乙醇溶液的极性会随着体积分数的增大而逐渐下降，因此在极性降低至一定程度后，原花青素在其中的溶解量会减少。

2.2 正交试验

通过单因素试验的结果，选定提取时间、提取温度、料液比和乙醇体积分数4个因素的最优条件设计正交试验，其他试验条件为，超声功率100 W，提取3次，每组试验均进行3次。

正交试验因素与水平设计见表1，正交试验L9（34）设计及结果见表2。

表1 正交试验因素与水平设计

表2 正交试验L9（34）设计及结果

由表2可知，花生红衣中原花青素最优提取条件为提取时间17.5 min，提取温度为30℃，料液比1∶16（g∶mL），提取剂为70%的乙醇溶液，超声功率100 W的条件下，提取3次。由极差分析可以看出各因素对花生红衣中原花青素提取影响的主次顺序为料液比（C）＞提取温度（B）＞提取时间（A）＞乙醇体积分数（D）。料液比对提取得率影响较大。选取最优提取条件提取原花青素，重复3次，得率为7.82%±0.02%。

2.3 花生红衣原花青素粗提物的纯化

对粗提物干物质使用香草醛-盐酸法进行纯度测定，所得纯度为34.28%±0.12%。使用AB-8型大孔吸附树脂分离纯化，测定洗脱曲线（见图2（a））。纯化后原花青素纯度为76.85%±0.24%，纯度较比未纯化前提升42.57%，纯度比较结果（见图2（b））。

原花青素粗提物的分离纯化见图2。

图2 原花青素粗提物的分离纯化

2.4 原花青素的抗氧化活性研究

原花青素的抗氧化活性见图3。

图3 原花青素的抗氧化活性

分别测定质量浓度为0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mg/mL的粗提物、纯化物样品的总还原力、超氧阴离子自由基的清除率、羟基自由基的清除率。测定质量浓度为0.01，0.02，0.03，0.04，0.05 mg/mL的粗提物、纯化物样品的对DPPH自由基的清除率。均以0.2 mg/mL维C溶液为对照。由图3（a）可知，在质量浓度0.1～0.5 mg/mL范围内，未纯化与纯化后的原花青素溶液的总还原力随质量浓度的增大而增强，在0.5 mg/mL质量浓度下达到最大，最大值为分别0.718±0.021和0.685±0.014。相同作用质量浓度下未纯化原花青素清除率与纯化原花青素总还原力无显著性差异，总还原力随原花青素质量浓度的升高而升高。相同质量浓度下花生红衣中原花青素的总还原力略低于维C，当原花青素质量浓度达到0.5 mg/mL时，与0.2 mg/mL的阳性对照维C总还原力能力相当。由图3（b）可知，在0.1～0.5 mg/mL质量浓度范围内，未纯化与纯化后的原花青素溶液对超氧阴离子自由基的清除率随质量浓度的增大而增大，在0.5 mg/mL质量浓度下达到最大，最大值分别为31.94%±5.1%和33.04%±5.2%。其中，未纯化原花青素清除率略低于纯化原花青素清除率。在同样的质量浓度下，花生红衣中原花青素对超氧阴离子自由基的清除效果低于维C。由图3（c）可知，在质量浓度0.1～0.5 mg/mL范围内，未纯化与纯化后的原花青素溶液对羟基自由基的清除率随质量浓度的增大而增大，在质量浓度0.5 mg/mL时达到最大，最大值分别为33.80%±6.22%和39.97%±3.72%。其中，未纯化原花青素清除率略低于纯化原花青素清除率。在同样的质量浓度下，花生红衣中原花青素对羟基自由基的清除效果低于维C。由图3（d）可知，在质量浓度0.01～0.02 mg/mL范围内，未纯化与纯化后的原花青素溶液对DPPH自由基的清除率随质量浓度的增大而增大，在质量浓度0.03～0.05 mg/mL范围内，对DPPH自由基的清除率几乎趋于恒定，在0.05 mg/mL质量浓度时达到最大，最大值分别为91.58%±0.14%和92.08%±0.01%。在同样的质量浓度下，未纯化原花青素清除率与纯化原花青素清除率无显著性差异。花生红衣中原花青素对DPPH自由基的清除效果远高于维C。

3 结论

通过单因素试验和正交试验论证，可知料液比对花生红衣中原花青素的提取影响较大，因此在工业生产中可严格控制提取过程中的料液比，适当改变其他条件来降低成本、提高得率，实现工业生产利益最大化。经过分析得出花生红衣中提取原花青素的最优提取工艺：超声功率100 W，提取温度30℃，提取时间17.5 min，按料液比1∶16（g∶mL）加入70%乙醇溶液作为提取剂，提取3次，合并滤液。在最优工艺条件下，花生红衣中提取原花青素的得率为7.82%±0.02%。将原花青素粗提物纯化后，纯度可达到76.85%±0.24%，较未纯化提升42.57%，同时抗氧化活性也有一定的提升，在工业上具有纯化价值。因此，花生红衣作为生产废料的再利用价值较高，花生红衣原花青素可作为一种天然抗氧化剂，广泛应用于食品、化妆品、保健品和医药领域。