黑腹果蝇和斑翅果蝇对‘玫瑰香’葡萄酸腐病的影响

高欢欢，覃冬云，陈迎春，代晓彦，吴新颖*

（1. 山东省葡萄研究院，山东济南 250100；2. 山东省农业科学院植物保护研究所，山东济南 250100）

葡萄酸腐病是果实采收期较为普遍的病害，主要表现为果实组织软化腐烂，呈现明显的醋酸气味，腐烂流出的汁液到达处引起进一步的感染，导致整穗葡萄染病腐烂，造成产量下降，严重时可导致绝产[1-3]。

由机械损伤或者气候原因、园区管理不当导致的果实裂果，给多种病原菌的侵染创造了有利条件，包括酵母菌、醋酸菌、真菌等[4-7]。Gao等[8]于2020年从山东烟台地区采集腐烂葡萄，经过分离鉴定，发现桔青霉（Penicillium citrinum）、层生镰刀菌（Fusarium proliferatum）、尖孢枝孢菌（Cladosporium oxysporum）、青霉菌（P. georgiense）、细极链格孢（Alternaria tenuissima）、黑曲霉（Aspergillus niger）、棘孢曲霉（A. aculeatus）、米曲霉（A.oryzae）与葡萄酸腐病密切相关。除此之外，果蝇也被认为是葡萄酸腐病重要的诱发因子和传播媒介，其中最广为人知的是黑腹果蝇（Drosophila melanogaster），是因醋酸菌以及酵母菌释放的代谢物质吸引而来，通过取食葡萄加速其腐烂[9]。但黑腹果蝇与特定真菌病原菌的关系并未有相关报道。另外，对葡萄生长期果蝇的发生规律进行调查后发现，黑腹果蝇主要发生在葡萄成熟期，而在始熟时诱集到大量的斑翅果蝇（D. suzukii）成虫[10]。也有报道证明，黑腹果蝇更偏好在腐烂的葡萄上产卵，而斑翅果蝇则偏好在完好的葡萄上产卵，二者的取食侵害可显著促进腐烂葡萄中醋酸菌的生长[11]。但是斑翅果蝇是否能够影响腐烂葡萄中真菌病原菌的致病性，并没有明确的报道。

因此，以前期发现的桔青霉、层生镰刀菌、尖孢枝孢菌、青霉菌、细极链格孢、黑曲霉、棘孢曲霉、米曲霉8种真菌为研究对象，通过将其与黑腹果蝇和斑翅果蝇分别联合侵害葡萄的方式，观察两种果蝇是否影响真菌在葡萄上的发病情况，从而明确两种果蝇与真菌病原菌的关系，为葡萄酸腐病的致病机理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 黑腹果蝇和斑翅果蝇

黑腹果蝇和斑翅果蝇来源于山东省农业科学院植物保护研究所的实验室种群。饲养条件：温度为25±1 ℃，相对湿度为60%±2%，光周期为16 h∶8 h（白天/黑夜）。

1.2 真菌

桔青霉、层生镰刀菌、尖孢枝孢菌、青霉菌、细极链格孢、黑曲霉、棘孢曲霉、米曲霉菌株为山东省葡萄研究院自存菌株。用打孔器收取菌饼分别放置于PDA培养基中央，在温度为25±1 ℃，相对湿度为60%±2%的人工气候箱中培养3～7 d，在菌落直径超过4 cm时取出，用于致病性试验。

1.3 葡萄样品

葡萄品种为‘玫瑰香’，于2020年8月采摘于济南仲宫实验站。采摘大小均一、成熟度一致的果穗（可溶性固形物16%）。剪取无损伤的果粒，用1%的NaClO溶液表面消毒1 min，然后在70%的酒精中浸泡1 min，用无菌水冲洗2次并晾干，用于致病性试验。

1.4 致病性试验

1.4.1 黑腹果蝇对8种真菌致病性的影响

用消毒解剖针在表面消毒过的健康葡萄中央刺一个2～3 mm深的小孔，以此模拟田间的机械损伤，用于下列试验。处理1（DM）：将10粒刺伤的葡萄放置于直径为15 cm培养皿中，收集10头黑腹果蝇成虫（雌雄比为1∶1）放入其中；处理2（Fungus1）：每种真菌分别制备浓度为1×106cfu/mL的孢子悬浮液，浸泡葡萄30 s，每10粒为1个重复；处理3（Fungus＋DM）：在葡萄上接种真菌后，收集10头黑腹果蝇成虫（雌雄比为1∶1）放入其中；处理4（CK）：以不接种真菌和黑腹果蝇的葡萄为对照。所有处理重复3次，置于27 ℃/25 ℃（白天/黑夜）和80% 湿度的培养箱中培养。分别在5 d和7 d后观察葡萄的发病情况。病情分级标准采用5级记载法[12-13]。0级：无病斑；1级：病斑面积占果实面积5%以下；3级：病斑面积占果实面积5%～25%；5级：病斑面积占果实面积25%～50%；7级：病斑面积占果实面积50%～75%；9级：病斑面积占果实面积75%以上。发病率和病情指数按照如下公式统计：

x是相对级值；n是每一级值中发病葡萄的粒数；N是调查的葡萄总粒数。

1.4.2 斑翅果蝇对8种真菌致病性的影响

试验设计参考1.4.1。处理5（DS）：将10粒表面消毒过的健康葡萄放置于直径为15 cm培养皿中，同时放入10头斑翅果蝇成虫（雌雄比为1∶1）；处理6（Fungus 2）：每种真菌分别制备浓度为1×106cfu/mL的孢子悬浮液，将消毒过的葡萄在孢子悬浮液中浸泡30 s，取出后置于上述条件的培养箱培养，每10粒葡萄为1个重复；处理7（Fungus＋DS）：在葡萄上接种真菌后，放入10头斑翅果蝇成虫（雌雄比为1∶1）；处理8（CK2）：以不接种真菌和斑翅果蝇的葡萄为对照。每个处理重复3次。样品培养和数据统计方法同1.4.1。

1.5 数据分析

4种处理条件下，对8种真菌的发病率、病情指数的显著性差异进行S-N-K检验，显著水平为P＜0.05。数据分析所用的软件为SPSS 20.0。

2 结果与分析

2.1 黑腹果蝇对真菌致病性的影响

在模拟田间条件使葡萄存在机械损伤的情况下，各处理中葡萄的发病率均为100%。待培养5 d后，黑腹果蝇取食后葡萄的病情指数明显高于对照。单独接种8种真菌对葡萄的致病性明显高于黑腹果蝇的为害程度。与真菌单独侵染相比，黑腹果蝇和桔青霉、层生镰刀菌、青霉菌、米曲霉联合侵害葡萄，使其病情指数显著降低。其中，青霉菌和黑腹果蝇复合侵害后葡萄的腐烂程度甚至低于单独黑腹果蝇的为害程度。另外，黑腹果蝇对尖孢枝孢属、细极链格孢、黑曲霉、棘孢曲霉的致病性没有显著影响（图1）。

真菌和黑腹果蝇联合侵害5 d时，由于黑腹果蝇的添加，真菌的菌丝面积减少；而取食7 d后，黑腹果蝇幼虫的孵化使葡萄的腐烂程度迅速增加。此时，8种真菌联合侵染的病情指数均高于单独侵染时的数值，其中桔青霉、层生镰刀菌、黑曲霉和棘孢曲霉的病情指数均高达100（图2）。

2.2 斑翅果蝇对真菌发病率的影响

培养5 d后，斑翅果蝇可对所有的葡萄造成危害，发病率均为100%，显著高于对照。尖孢枝孢菌和黑曲霉侵染葡萄后明显低于斑翅果蝇的致腐率。与真菌单独侵染相比，斑翅果蝇与真菌联合侵害并没有显著影响葡萄的发病率。培养7 d后，斑翅果蝇和黑曲霉联合侵害葡萄后，降低了黑曲霉的发病率。斑翅果蝇对其他7种真菌的发病率均无影响（图3）。

2.3 斑翅果蝇对真菌病情指数的影响

在无机械损伤的前提下，分别接种真菌和斑翅果蝇，培养5 d后，真菌单独侵染的病情指数高于对照组，却明显低于斑翅果蝇侵害后造成的葡萄病情指数。而斑翅果蝇与桔青霉、层生镰刀菌、青霉菌、细极链格孢和棘孢曲霉联合侵害后，与单独接种真菌相比，葡萄腐烂程度明显增加。斑翅果蝇与尖孢枝孢菌、米曲霉联合侵害葡萄并没有增加其致病能力，而黑曲霉在斑翅果蝇联合侵害下反而降低了黑曲霉的致病能力（图4）。

图1 培养5 d后黑腹果蝇对8种真菌病情指数的影响Figure 1 Effects of D. melanogastor on disease index of eight fugus species after cultivating five days

图2 培养7 d后黑腹果蝇对8种真菌病情指数的影响Figure 2 Effects of D. melanogastor on disease index of eight fugus species after cultivating sevne days

图3 斑翅果蝇对8种真菌发病率的影响Figure 3 Effects of D. suzukii on morbidity of eight fugus species

图4 培养5 d后斑翅果蝇对8种真菌病情指数的影响Figure 4 Effects of D. suzukii on disease index of eight fugus species after cultivating five days

图5 培养7 d后斑翅果蝇对8种真菌病情指数的影响Figure 5 Effects of D. suzukii on disease index of eight fugus species after cultivating seven days

培养7 d后，各处理的葡萄病情指数均有所上升（图5）。桔青霉、层生镰刀菌、青霉菌、细极链格孢、棘孢曲霉与斑翅果蝇联合侵害葡萄的病情指数明显高于真菌单独危害和斑翅果蝇单独侵害。尖孢枝孢菌、黑曲霉、米曲霉与斑翅果蝇联合侵害的病情指数与真菌单独危害均无显著差异，但仍低于斑翅果蝇对葡萄造成的损伤。

3 讨论与结论

黑腹果蝇为腐生昆虫，喜食腐烂食物，实则是取食腐烂食物中滋生的微生物或其代谢物质，例如酵母以及醋酸菌的代谢产物[14]。研究中，黑腹果蝇真菌感染的葡萄上产卵初期，导致真菌菌丝面积明显减少，桔青霉、层生镰刀菌、青霉菌、米曲霉4种真菌的病情指数显著降低，说明在卵未孵化时，黑腹果蝇的成虫取食真菌菌丝而导致其发育受到抑制。而在黑腹果蝇产卵7 d后，孵化为幼虫取食果肉，增强8种真菌的致病力。

目前，果蝇与葡萄酸腐病之间关系的研究主要以醋酸菌为研究对象。Ioriatti等[15]发现，完整的葡萄果实对醋酸菌的敏感性较低，而斑翅果蝇的产卵增加醋酸菌侵染的风险，而且斑翅果蝇卵孵化为幼虫后，醋酸菌的数量以及乙酸的浓度比卵未孵化时要高，醋酸菌的代谢物质诱集大量黑腹果蝇产卵取食，加重酸腐病的发生程度和面积[16]。但果蝇的取食并不能促进腐烂葡萄中毕赤酵母（Pichia terricola）、孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）、株假丝酵母属（Candida zemplinina）和结合囊酵母（Zygoascus hellenicus）等酵母属真菌的发育[17]。以真菌为研究对象发现，完整新鲜的葡萄对8种真菌的敏感性明显低于斑翅果蝇。斑翅果蝇的取食，可为桔青霉、层生镰刀菌、青霉菌、细极链格孢和棘孢曲霉侵染提供更为有利的环境。但尖孢枝孢菌、米曲霉和黑曲霉并没有由于斑翅果蝇的取食而增加其致病力。说明斑翅果蝇并不能促进腐烂葡萄中所有微生物的发育，且抑制黑曲霉的发育，可能是因为斑翅果蝇分泌的代谢物质具有抑菌作用，但仍需要进一步的验证。

另外，在人工饲料中的白地霉（Geotrichum candidum）和放射状毛霉（Actinomucor elegans）增加了斑翅果蝇的繁殖量，而篮状菌属（Talaromyces minioluteus）则抑制了斑翅果蝇的发育[18]，但腐烂葡萄中真菌的侵染是否影响两种果蝇的生长发育也需要进一步的研究。试验首次将与葡萄酸腐病相关的真菌病害为对象，研究结果可为探索两种果蝇、葡萄与真菌之间的关系提供重要的理论基础。