刚毛柽柳ThPCS1基因克隆与镉胁迫应答分析

王培龙，杨 妮，张傲然，唐努尔·塞力克，李 爽，高彩球

(林木遗传育种国家重点实验室(东北林业大学)，黑龙江 哈尔滨 150040)

重金属污染是威胁人类健康的主要问题之一。有毒重金属通常作为土壤成分存在，或者通过人类活动在环境中扩散。重金属镉(Cd)对土壤的污染危害有两个方面：一方面，镉影响作物的生命周期，从而降低作物产量；另一方面，镉一旦被吸收并积累到植物组织中，便进入食物链，进而使动物和人中毒。植物吸收是镉进入食物链的主要途径，会对人类健康造成严重影响[1]。

植物暴露于镉胁迫下可能会导致许多细胞生物学过程和结构发生变化。镉在植物中的积累会导致光合作用以及水分和养分的吸收减少，酶活性受到抑制，细胞转运过程遭到破坏，细胞氧化还原控制被破坏并影响植物根和茎的生长[2]。此外，镉的存在会干扰植物中过氧化氢(H2O2)的积累，并干扰涉及活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的信号转导途径。Cd2+在化学上与锌离子(Zn2+)非常相似，会阻碍锌指转录因子的活性，取代Zn2+，从而干扰基因转录过程[3]。通过类似的机制，Cd2+替代钙调蛋白中的Ca2+，引起细胞内钙水平的波动并改变钙依赖性信号的传导[4]。

镉被植物吸收后，通过金属转运体或钙通道转运到根中。在细胞内，镉优先通过与含硫的配体(例如金属硫蛋白、谷胱甘肽和植物络合素)结合而被解毒，并且配体-镉复合物会从敏感的细胞器和结构中被去除掉[5]。植物络合素(phytochelatins，PCs)是植物和一些非植物生物特有的金属结合肽，PCs的合成是通过植物络合素合酶(phytochelatin synthase，PCS)与有害元素如砷(As)和Cd的接触来诱导谷胱甘肽(glutathione，GSH)完成的[6]。

目前，已经从多种植物和某些微生物中鉴定出PCS基因。这些物种包括小麦(Triticumaestivum)[7]、水稻(Oryzasativa)[8]、拟南芥(Arabidopsisthaliana)[9]、芥菜(Brassicajuncea)[10]、鼠耳芥(A.thaliana)[11]、天蓝遏蓝菜(Thlaspicaerulescens)[12]；裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)[13]和秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)[14]等。多项研究已证明PCS基因能对镉胁迫作出应答，并在重金属镉和一些其他离子的螯合中起重要作用，从而增强植物的重金属耐受性。例如，在拟南芥发育的早期阶段，AtPCS1基因在镉胁迫下表达水平较高[15]。在镉处理1周的成年拟南芥中AtPCS1基因的表达显著增加[16]。转AtPCS1基因印度芥菜对镉和锌胁迫的耐受性明显增高，并且它们在芽和根组织中都显示出比野生型较少的积累[17]。TaPCS1的过表达使酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的镉耐受性更强[13]。百脉根(Lotusjaponicus)中，PCS的剪接变体LjPCS1-3对镉处理显示出不同的反应[18]。过表达NtPCS1基因导致转基因烟草(Nicotianatabacum)对镉和亚砷酸盐的耐受性升高[19]。

刚毛柽柳(Tamarixhispida)是柽柳科柽柳属植物，可在砾石、戈壁、黏土、沙土、流沙及各种不同程度的盐渍化土壤中和各种典型的盐土中生长，可作为抗逆基因克隆和抗逆机制研究的理想材料[20]。目前对刚毛柽柳镉胁迫相关研究发现刚毛柽柳具有较强的镉胁迫耐受能力。转录组分析结果显示，镉胁迫后刚毛柽柳多条代谢途径和相关基因的表达发生了改变。进一步的研究发现金属硫蛋白(metallothionein，MT)基因ThMT1的过量表达提高了烟草的抗Cd2+能力[21]，柽柳真核翻译起始因子(eukaryotic translation initiation factor，eIF)基因TheIF1A具有提高烟草的耐氯化镉(CdCl2)胁迫的能力[22]，转硫氧还蛋白过氧化物酶(peroxiredoxin，Prx)ThPrx1或热休克蛋白(heat shock protein，HSP)ThHSP18.3基因酵母具有更强的Cd2+耐受能力[23-24]，转液泡膜H+-ATPase c亚基(vacuolar membrane H+-ATPase c subunit，VHAc)ThVHAc1基因的酵母和拟南芥均具有更高的Cd2+承受能力[25-26]。为了进一步研究刚毛柽柳耐镉胁迫分子机制，了解耐镉基因功能，同时鉴于PCS基因在其他植物耐镉方面的重要作用，本研究拟对刚毛柽柳PCS基因功能进行初步研究。

本研究克隆刚毛柽柳ThPCS1基因，通过生物信息学方法分析该基因的序列特征和进化关系。通过实时荧光定量PCR技术(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)分析镉胁迫条件下ThPCS1基因在柽柳根和叶中的表达情况。同时构建ThPCS1基因过表达载体(pROKⅡ-ThPCS1)，并瞬时转化至柽柳，分析过表达植株和对照植株在镉胁迫处理之后相关生理指标的变化情况。初步鉴定刚毛柽柳ThPCS1基因的功能，为刚毛柽柳耐镉机制研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料及胁迫处理

将刚毛柽柳种子种植于塑料筐中，栽培基质为体积比1∶1的泥炭土和砂子混合基质。在温室中进行培养，培养条件为平均温度24 ℃，光周期为光照14 h 黑暗10 h，相对湿度为70%～75%。将生长2个月的刚毛柽柳幼苗用150 μmol/L CdCl2溶液进行浇灌处理，处理时间分别为1、3、6、9、12、24、48和72 h，同时以正常浇水刚毛柽柳材料作为对照。每个处理重复3次，且至少处理80棵苗。胁迫处理后，分别取刚毛柽柳的根部和叶部组织，经液氮速冻后，冻存于-80 ℃冰箱用于后续RNA提取。

1.2 ThPCS1基因的查找以及克隆

以“phytochelatin synthase”为关键词，对实验室前期获得的刚毛柽柳转录组数据进行查找，获得PCS基因的转录本序列，运用BioEdit软件比对筛选，去除序列相同的转录本，并通过BLASTX(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)筛选具有完整开放阅读框(open reading frame，ORF)的ThPCS基因。以ThPCS1-T-F：ATGGCGATGGCTGGACTGTAC和ThPCS1-T-R：AGAGGATAGCGTAGCTGCTGAGTTCTC为上游和下游引物，以刚毛柽柳cDNA为模板进行ThPCS1基因的逆转录PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)克隆，RT-PCR反应体系为：模板2 μL，基因上下游引物各1 μL，dNTP Mix(10 mmol/L)0.4 μL，10×LATaqPCR buffer 2 μL，LATaq(5 U/μL)0.3 μL，无菌水补充至20 μL。反应程序为：95 ℃预变性3 min, 95 ℃变性30 s, 59 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min 30 s，30个循环，72 ℃延伸10 min。取20 μL反应产物进行电泳检测，选取片段大小正确的基因片段进行回收。将胶回收片段与T载体进行连接，将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞中，并涂布于含有50 mg/L氨苄青霉素(ampicillin，Amp)的固体LB培养基中，37 ℃培养8 h。挑取单克隆菌落，用载体通用引物和基因引物分别进行PCR验证，选取条带大小正确的菌株进行测序分析。

1.3 ThPCS1基因的生物信息学分析

利用ProtParam计算ThPCS1基因编码蛋白的相对分子质量及理论等电点；利用Expasy-prosite在线工具对ThPCS1蛋白的结构域预测；利用NCBI中的BLASTP(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome)程序对ThPCS1氨基酸序列进行比对，搜索与刚毛柽柳同源性较高的13种植物的PCS氨基酸序列，包括葡萄(Vitisvinifera)、藜麦(Chenopodiumquinoa)、菠菜(Spinaciaoleracea)、梅花(Prunusmume)、婆罗门柳(Salixbrachista)、巴西橡胶树(Heveabrasiliensis)、黄连木(Pistaciachinensis)、茶树(Camelliasinensis)、三裂叶薯(Ipomoeatriloba)、黄花烟草(Nicotianarustica)、茸毛烟草(Nicotianatomentosiformis)、甜樱桃(Prunusavium)、漾濞槭(Aceryangbiense)。利用Clustalx 1.83软件进行序列多重比较分析。

1.4 RNA提取以及RT-qPCR

采用植物RNA提取试剂盒(BioTeKe coropration，北京百泰克生物技术有限公司)提取刚毛柽柳各个处理样品的RNA，具体方法参考说明书。利用凝胶电泳和Nanovue微型光度计测定RNA的质量和浓度。取1 μg合格的RNA样品进行反转录，RNA反转录及cDNA合成采用TransScript One-step gDNA Remvoal and cDNA Synthesis SuperMix试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)，具体操作方法按照说明书进行。将反转录获得的cDNA稀释10倍后用于RT-qPCR分析。选择柽柳Actin、α-tubulin和β-tubulin基因作为RT-qPCR的内参基因。内参和ThPCS1基因定量引物序列见表1。

表1 RT-qPCR和载体构建引物序列

RT-qPCR反应体系为：SYBR Green Mix 10 μL，正反向引物(10 μmol/L)各1 μL，cDNA 2.0 μL，ddH2O补充到20 μL。反应程序为：95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，45个循环。每个样品重复3次。使用德国耶拿公司生产的qTOWER 2.0荧光定量PCR仪进行RT-qPCR实验。数据采用2-ΔΔCt法[27]分析。

1.5 ThPCS1基因植物过表达载体的构建

根据植物过表达载体pROKⅡ的多克隆位点以及ThPCS1基因的序列特征设计引物。在ThPCS1基因引物的5′端和3′端分别引入BamH I和KpnI限制性内切酶位点(引物ThPCS1-F和ThPCS1-R)。以刚毛柽柳cDNA为模板，通过RT-PCR扩增获得ThPCS1基因片段。经酶切纯化后，将基因片段和载体片段进行连接，通过热激法转入大肠杆菌感受态细胞Top10，在含有卡那霉素的LB培养基上37 ℃培养8～12 h，挑取单菌落分别使用载体引物和基因引物进行PCR验证，选取片段大小正确的菌株测序分析。将测序正确的过表达载体菌株命名为pROKⅡ-ThPCS1，提取质粒后转化至根癌农杆菌EHA105，获得基因过表达菌株。

1.6 ThPCS1基因瞬时转化刚毛柽柳耐镉能力分析

根据Zhang等[28]的方法，将含有pROK Ⅱ-ThPCS1过表达载体(OE)和pROK Ⅱ空载体(CK)农杆菌分别对刚毛柽柳进行瞬时侵染，培养36、48、72 h后收集材料，进行RNA提取和RT-qPCR分析。此外，侵染材料进行24 h培养后，用100 μmol/L CdCl2处理12 h，同时将在正常MS培养基上培养的瞬时侵染柽柳苗作为对照。镉处理结束后，分别对转基因植株和对照植株的镉离子含量、叶绿素含量、H2O2以及丙二醛(malondialdehyde，MDA)等生理指标进行测定。同时对处理3 h的样品进行化学染色，所用染料有氯化硝基四氮唑蓝(nitrotetrazolium blue chloride，NBT)、二氨基联苯胺(diaminobenzidine, DAB)和伊文思蓝(evans blue)等。每个试验重复3次，每个株系至少含有15株柽柳苗。

1.7 统计分析

使用IBM SPSS Statistics 19软件的t检验对数据进行统计分析与显著性检验。

2 结果与分析

2.1 ThPCS1基因的克隆及生物信息学分析

以“phytochelatin synthase”作为关键词，对实验室前期获得的柽柳转录组数据进行查找，获得一条ThPCS基因序列(图1)。

A.ThPCS1蛋白保守结构域分析ThPCS1 protein conserved domain analysis；B.ThPCS1蛋白与其他13种植物PCS蛋白的多序列比对分析ThPCS1 protein and 13 other plant PCS proteins multiple sequence alignment analysis。●和▲表示严格保守的半胱氨酸(Cys)残基和催化三联体[拟南芥中的Cys56、异亮氨酸(His)162和天冬酰胺(Asp)180[29]]，表示保守的Cys残基。The line marked ● and ▲ respectively showed the strictly conserved Cys residues and the catalytic triad (Cys56, His162 and Asp180 in Arabidopsis[29]). The line marked showed the conserved Cys residues.序列下方的灰色和黑色线分别表示植物络合素N端(PF05023)和植物络合素C端(PF09328)结构域的位置。The grey and black lines below sequences indicate the approximate positions of the N-terminal (PF05023) and C-terminal (PF09328) domains of phytochelin respectively.图1 刚毛柽柳ThPCS1蛋白结构分析Fig.1 The structure analyses of T. hispIda ThPCS1 protein

BLASTx以及ORFfinder分析结果显示，柽柳ThPCS1基因ORF长1 581 bp，编码526个氨基酸。以柽柳cDNA为模板，以ThPCS1-T-F和ThPCS1-T-R为上下游引物进行PCR扩增，结果显示所获得的条带特异，大小符合。回收后连接T载体并转化大肠杆菌，将菌液PCR检测得到的阳性克隆菌株进行测序验证，序列分析结果显示所获得的ThPCS1基因序列正确。

ProtParam分析发现ThPCS1蛋白的分子质量为130.75 ku，理论等电点pI为5.0。Expasy-prosite在线工具预测结果表明ThPCS1蛋白的N端具有保守的植物络合素合酶结构域(图1A)。ThPCS1以及13个不同物种的PCS氨基酸序列多序列比对结果显示，ThPCS1与所选物种的氨基酸序列之间具有较高的同源性(相似性为77%～81%)，都含有典型的PCS结构域(图1B)。

2.2 镉处理下刚毛柽柳ThPCS1基因的表达分析

为了初步判断ThPCS基因是否具有耐镉能力，利用RT-qPCR技术分析了刚毛柽柳幼苗在CdCl2处理后的表达情况(图2)。RT-qPCR结果显示，CdCl2处理24 h，根中ThPCS1基因的表达明显上调，是空白对照的16.21倍，其他胁迫时间点，变化不明显。与根中的表达趋势不同，ThPCS1基因在叶中的表达大部分时间点都明显下调(除72 h无明显改变)，且在24 h时达到最低值(对照的5.8%)。以上结果表明ThPCS1基因能对镉胁迫做出明显应答，且具有典型的组织特异性表达特性。

图2 CdCl2胁迫处理条件下ThPCS1基因在根和 叶中的表达模式Fig.2 RT-qPCR analyses of ThPCS1 gene in roots and leaves under CdCl2 stress

2.3 过表达ThPCS1基因刚毛柽柳耐镉能力分析

将构建成功的pROKⅡ-ThPCS1重组载体瞬时转化至刚毛柽柳，培养36、48、72 h后提取RNA，反转录并进行RT-qPCR分析。结果显示，对照植株中ThPCS1基因表达量在所有时间点都无明显变化，而过表达植株中，ThPCS1基因的表达量明显增加，其中36 h表达量达到最高(图3A)。表明成功获得了转ThPCS1基因刚毛柽柳，且瞬时转化36 h后ThPCS1基因表达量最高。

图3 镉胁迫瞬时转化ThPCS1 基因刚毛柽柳相关生理指标及化学染色分析Fig.3 The physiological indexes and chemical staining analysis of transient overexpression ThPCS1 T. hispida under cadmium stress

进一步分析比较了过表达ThPCS1基因和对照柽柳在CdCl2胁迫处理12 h后的染色和相关生理指标情况，结果显示，非胁迫条件下，过表达和对照植株中镉离子、叶绿素、H2O2和丙二醛含量差异也不明显；而在CdCl2胁迫处理下，过表达和对照植株中镉离子的含量均明显上升，但过表达植株中镉离子的积累量要显著少于对照植株(P< 0.05)，是对照的76.4%(图3B)。同样，CdCl2处理后，H2O2与MDA含量也均有增加，但是过表达植株中增加的要显著低于对照植株(P< 0.05)，分别是对照的63.5%和70.8%(图3C、3D)。过表达和对照植株中叶绿素含量在CdCl2胁迫处理后减少，但与对照植株相比，过表达植株中叶绿素含量减少较少，过表达植株叶绿素含量是对照植株的1.6倍(图3E)。非胁迫处理条件下，转基因和对照植株的DAB、NBT和evans blue染色结果差异不大；但是在镉胁迫条件下，转基因植株的DAB、NBT和evans blue着色均比对照植株浅(图3F)，以上结果表明在镉胁迫条件下过表达ThPCS1基因植株减少了镉离子和活性氧含量，细胞受损较小，转基因柽柳的耐镉能力提高。

3 讨 论

重金属镉被植物体吸收后，会在细胞内积累，造成细胞膜脂过氧化和膜电位去极化,使细胞质膜的完整性受到伤害，导致细胞内重要的物质大量外渗同时外界环境中有毒的物质进入细胞，从而对植物生长造成损伤。植物络合素酶通过合成由PC2到PC6的植物络合素来螯合细胞内游离态的重金属，并对他们进行区域化隔离，是植物、藻类、真菌以及部分动物体内普遍存在的一种应对重金属毒害的稳态机制[31]。

本研究从刚毛柽柳中克隆获得1条ThPCS1基因，序列分析表明ThPCS1含有典型的PCS结构域，包括N末端的5个和C末端的1个Cys残基。研究发现，N末端核心结构域赋予PCS活性，而C末端提高了蛋白质的稳定性，更高的PCS活性和更宽的重金属谱，N端的5个保守Cys残基和C端区域的保守Cys残基参与了重金属结合[32]。

RT-qPCR技术对镉胁迫处理后刚毛柽柳ThPCS1基因的表达分析表明，ThPCS1基因在根和叶中呈现出不同的表达趋势，根中在24 h时被明显诱导表达，而叶中在绝大部分时间点都被抑制表达。说明ThPCS1基因的表达受镉胁迫影响。前人研究也发现一些物种在镉胁迫后，PCS基因的表达发生了明显的改变，如芥菜长期暴露于镉胁迫情况下，PCS蛋白在芥菜叶子和根中均被诱导表达[10]；PCS1和PCS2基因在拟南芥和鼠耳芥茎尖和根中的表达被不同浓度的CdSO4诱导[11]；在拟南芥发育的早期阶段，AtPCS1基因的表达在Cd处理情况下被诱导，在镉处理1周的成年拟南芥中AtPCS1基因的表达也显著增加[15-16]。同时，研究发现在镉胁迫处理下MsPCS1基因在苜蓿(Medicagosativa)根和茎尖中的表达表现出轻微的下调趋势[33]。

为进一步分析ThPCS1基因在柽柳中的耐镉能力，本研究构建了ThPCS1基因过表达载体并瞬时转化刚毛柽柳并进行镉胁迫处理。结果显示，过表达植株中镉离子的含量低于对照植株，与细胞损伤和活性氧相关的指标(MDA和H2O2)在过表达植株中的含量显著低于对照植株，而叶绿素的含量在过表达植株中则高于对照。有研究表明PCS基因能螯合金属离子Cd并减轻Cd对植物的毒害作用[34-35]。Cd胁迫处理情况下，在拟南芥中过表达番薯(Ipomoeabatatas)IpPCS1t基因会导致拟南芥的发芽率、根长和鲜质量等指标明显增加[36]；过表达甘蓝型油菜(Brassicanapus)三重BnPCS基因于拟南芥突变体cad1-3中增强了植株镉的积累和转运[37]。因此，笔者推测ThPCS1基因也可能通过螯合植株中的Cd离子，减少胞内Cd离子含量，进而降低膜质的氧化程度，以保持细胞质膜的完整性，避免细胞内重要的物质大量外渗等方式提高转基因植株的抗重金属能力。

有研究发现在过表达OsHMA3的水稻和小麦中镉离子含量较低，且在幼嫩部位的积累明显低于根部，这可能和过表达基因减少对镉离子的吸收以及镉离子分布在植物体内的区间化相关[38-40]。过表达ThPCS1基因可能也存在类似的作用机制，即通过减少镉离子的吸收和对镉离子的区间化处理来增强植株的镉胁迫耐受性。在后续研究中，将对刚毛柽柳ThPCS1基因耐Cd胁迫的机制进行进一步研究。