白酒糟纤维素降解菌的分离筛选及发酵条件优化

宁露佳，刘倩楠，景 雯，杨月轮，李彦芹

（河北大学 生命科学学院，河北 保定 071002）

酒糟是酿酒产业生产的主要副产物，含有蛋白质、粗纤维、有机酸、糖类、氨基酸等丰富的营养物质[1-2]。2018年中国白酒产量为871万kL，每生产1 t的白酒约产生3 t的酒糟，目前我国每年产生的白酒糟总量超过2 500万t[3]。如此庞大的酒糟不能合理利用将会是资源浪费，也会污染环境。许多企业直接将酒糟作为饲料饲喂动物，但酒糟有20%左右的纤维素，含量大，易造成动物消化吸收利用率低，而且适口性差。如果可以降低酒糟的纤维素含量，弥补酒糟饲料的缺陷，增强口感，在一定程度上提高酒糟的饲喂价值，对白酒糟发酵饲料生产技术的应用和推广具有重要意义，因此充分利用酒糟中的纤维素成为酒糟资源化利用的关键[5]。

纤维素是一种葡萄糖单元聚合物，由β-1,4糖苷键连接而成[6]，自然界中纤维素来源丰富且分布广泛，是巨大的可再生资源[7]。纤维素酶是能够分解纤维素的一种复合酶[8]，自然界中产纤维素酶的微生物种类繁多，主要包括真菌、放线菌、细菌等[9]。景如贤等[10]在落叶土壤中筛选出一株羧甲基纤维素（carboxymethyl cellulose，CMC）酶活为1.456 U/mL的芽孢杆菌；李乐等[11]在腐烂秸秆中筛选出一株CMC酶活为5.41 U/mL的烟曲霉；刘最等[12]在腐木土壤中筛选出CMC酶活为11.057 U/mL的土曲霉原变种。目前为止，降解纤维素的方法有物理、化学和生物法。物理、化学方法处理废物费用高、污染环境，而生物法具有高效、环保、专一性强等优越性[13]，所以如何利用微生物降解纤维素已经成为热点。将高效菌株应用到酒糟中，提高酒糟的利用价值，不仅能减少环境污染，还能带来一定的经济价值。本试验从土壤和粮食型酒糟中筛选出纤维素酶活较高的菌株，为后期制备生物饲料提供一定的理论依据，加强酒糟的资源利用化，促进白酒业的持续发展。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

白酒糟：沧州十里香酒厂粮食型白酒酒糟（将酒糟在50 ℃的烘箱烘干，粉碎过10目筛备用）；土壤：河北大学松树下的腐殖土。

1.1.2 试剂

酒石酸钾钠（分析纯）、刚果红：天津市科密欧化学试剂有限公司；苯酚（分析纯）：福晨（天津）化学试剂有限公司；3,5-二硝基水杨酸（分析纯）：天津市大茂化学试剂厂；羧甲基纤维素钠（carboxymethylcellulose sodium，CMC-Na）：国药集团化学试剂有限公司。

1.1.3 培养基

富集培养基：酒糟10 g、蛋白胨1 g、NaCl 5 g、CaCl20.1 g、KH2PO41 g、（NH4）2SO42 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、滤纸条1 cm×5 cm 5条、蒸馏水1 L，pH自然。

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、琼脂20 g、蒸馏水1 L，pH 7.0～7.2。

马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、蒸馏水1 L，pH自然。

高氏一号培养基：可溶性淀粉20 g、NaCl0.5 g、KNO31 g、K2HPO4·3H2O 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、琼脂20 g、蒸馏水1 L，pH自然。

孟加拉红培养基：北京奥博星生物技术有限责任公司。

LB培养基：胰蛋白胨10 g、酵母浸粉5 g、NaCl 10 g、蒸馏水1 L，pH自然。

液体牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、蒸馏水1 L，pH 7.0～7.2。

纤维素刚果红培养基：刚果红0.4 g、CMC-Na 2 g、（NH4）2SO42 g、K2HPO41 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、NaCl 0.5 g、蒸馏水1 L，pH自然。

滤纸条培养基：酵母膏3 g、（NH4）SO42 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KH2PO41 g、蛋白胨5 g、滤纸条1 cm×5 cm、蒸馏水1 L，pH自然。

发酵培养基：酒糟10 g、蛋白胨5 g、NaCl 5 g、KH2PO41 g、（NH4）SO42 g、MgSO4·7H2O 0.5 g蒸馏水1 L，pH自然。

所有培养基均在121 ℃灭菌20 min。

1.2 仪器与设备

LDZX-50FBS立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；SPX型生化培养箱：宁波江南仪器厂；ZWY-2102摇床：上海智城分析仪器制造有限公司；BJ-2CD超净工作台：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；722E型可见光分光光度计：上海光谱仪器有限公司；Gel DocTMXR+紫外凝胶成像系统：美国SIM International Group Co.，Ltd。

1.3 实验方法

1.3.1 富集与分离

称取10 g的土样倒入装有90 mL无菌水的500 mL锥形瓶中，30 ℃下振荡30 min，吸取5 mL上清液，加入到富集培养基中，30 ℃振荡培养，直到滤纸全部分解，转接新的富集培养基中，重复3～4次。

吸取1 mL的富集液，用无菌水进行梯度稀释，取10-1、10-2、10-3、10-4、10-5梯度的稀释液，分别涂布到牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号培养基、孟加拉红培养基上，分离出细菌、放线菌和霉菌，经过划线分离纯化得到单菌落，挑取单菌落斜面4 ℃保存。

1.3.2 纤维素降解菌的初筛

（1）刚果红染色试验

分别挑取各菌株点接到刚果红培养基上，在30 ℃条件下培养3 d，每组做3个平行，观察刚果红培养基上是否有透明圈，测量透明圈直径（D）和菌落直径（d）的大小，根据直径比（D/d），初步筛选出纤维素酶活较高的菌株。

（2）滤纸崩解试验

将各菌株接种到滤纸条培养基中，在30 ℃、200 r/min摇床上振荡培养观察，根据滤纸条的腐烂程度和速度，选取纤维素酶活较高的菌株进行复筛。

1.3.3 纤维素降解菌的复筛

种子液制备：将选出的酶活较高的细菌接到LB培养基中，30 ℃培养12～24 h至对数期（OD600nm值=0.4～0.5）备用；霉菌接种到PDA培养基上，30 ℃下倒置培养，待长满孢子后，用无菌水冲洗孢子，制成孢子数为1×107个/mL的孢子悬浮液备用。

粗酶液的制备：种子液按6%（V/V）的接种量接种到发酵培养基中，30 ℃、200 r/min振荡培养4 d，将发酵液4 000 r/min离心10 min，取上清液获得粗酶液。

酶活的测定：纤维素酶活和滤纸酶活测定采用中华人民共和国轻工行业标准QB 2583—2003《纤维素酶制剂》[14]。

1.3.4 菌株的鉴定

形态观察：观察单菌落在PDA平板上的形态、形状、颜色、边缘等；参考《真菌鉴定手册》[15]在显微镜下观察菌丝的形态。

分子生物学鉴定：提取目的菌株脱氧核糖核酸（de oxyribonucleic acid，DNA）进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增，然后将产物送至生物公司进行测序。测序结果在美国国家生物技术信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）上进行BLAST序列比对，确定目的菌株的进化关系[16]。

1.3.5 发酵条件优化

考察发酵温度（10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃）、发酵时间（1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d）、初始pH值（2、3、4、5、6、7）、碳源（酒糟、CMC-Na、滤纸、稻壳、葡萄糖、玉米粉）、氮源（蛋白胨、豆饼、麸皮、酵母膏、硝酸钾、硫酸铵、氯化铵、尿素、牛肉膏）这5个单因素对菌株产酶的影响。

1.3.6 纤维素酶的最佳反应温度

将菌株在最佳发酵温度下培养4 d，离心后所得的粗酶液分别在10 ℃、15 ℃、20 ℃、30 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃的温度下水浴反应30 min，通过比较酶活的高低，确定菌株纤维素酶的最佳反应温度。

2 结果与分析

2.1 菌株初筛结果

经过刚果红染色和滤纸崩解试验后，共筛选出8株纤维素酶活较高的菌株，分别命名为M1、M2、M3、M4、M5、X1、X2、F1，其D/d值与纸条崩解情况见表1。由表1可知，水解圈和菌落直径比值从小到大依次为菌株M2、X2、X1、M3、M5、M1、F1、M4，透明圈最大的为菌株M2，D/d值为7.5。菌株X1崩解最好，菌株X2在培养15 d内没有崩解，其余菌株都有部分崩解。崩解速度越快，说明菌株纤维素酶活越高，表明除菌株X2外，其余菌株均有较高的纤维素酶活。

表1 刚果红染色结果及15 d内滤纸条崩解情况Table 1 Congo red staining results and disintegration of filter strips within 15 d

2.2 复筛结果

复筛酶活测定结果见表2。由表2可知，菌株M5的酶活最高，这与刚果红透明圈和滤纸条崩解结果不一致，这可能与细菌和真菌产生的纤维素酶的机理有关。细菌产纤维素酶较少，主要产葡聚糖内切酶，大多数酶对结晶纤维素无降解活性；而真菌产酶性能较高，且多为胞外酶[17]。有研究发现，透明圈直径的大小与CMC酶活力没有明显的相关性[18]。综上所述，确定菌株M5纤维素降解能力最强。

表2 纤维素降解菌株复筛结果Table 2 Re-screening results of cellulose-degrading strains

2.3 菌株M5的鉴定

2.3.1 菌株M5的形态观察

菌株M5在PDA平板上培养3 d后的菌落形态见图1。由图1可知，菌落起初是白色菌丝，比较疏松，培养2 d后，可铺满90 mm的平板，在平板中间开始产生绿色的孢子，并逐渐铺满整个平板。菌株M5的显微观察结果显示，菌株M5分生孢子无色，球形至卵形；不孕菌丝稀少；分生孢子梗呈二叉或三叉状分支，有隔膜，垂直生长，主分支呈树状，顶枝尖端细，微弯曲，尖端生分生孢子团；初步鉴定为木霉属（Trichoderma）。

图1 菌株M5在PDA平板上的菌落形态（A）及显微形态（B）观察结果Fig.1 Colony morphology on PDA plate (A) and microscopic observation (B) results of strain M5

2.3.2 菌株M5的分子生物学鉴定

构建菌株M5的系统进化树，结果见图2。由图2再结合菌株的形态特征，鉴定菌株M5为木霉属的棘孢木霉（Trichoderma asperellum）。

图2 基于ITS基因序列菌株M5的系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree of strain M5 based on ITS gene sequences

2.4 菌株M5产酶发酵条件优化

2.4.1 发酵温度对菌株M5产酶的影响

发酵温度对菌株M5产酶影响见图3。由图3可知，随着温度的升高，CMC酶活和滤纸酶活逐渐增加，在20 ℃时达到最大值，酶活分别为11.50 U/mL和4.61 U/mL，之后随着温度的升高，酶活都降低，CMC酶活与滤纸酶活的变化趋势保持一致。菌株M5在20 ℃条件下有较高的酶活，说明是一株耐低温菌株。

图3 发酵温度对菌株M5产酶的影响Fig.3 Effect of fermentation temperature on enzyme production of strain M5

2.4.2 发酵时间对菌株M5产酶的影响

发酵时间对菌株M5产酶的影响见图4。由图4可知，在1～5 d内，菌株M5的酶活逐步上升，在第5天时，酶活达到最高，此时CMC酶活和滤纸酶活分别为9.35 U/mL和3.92 U/mL，在5 d以后，酶活逐渐下降。

图4 发酵时间对菌株M5产酶的影响Fig.4 Effect of fermentation time on enzyme production of strain M5

2.4.3 初始pH对菌株M5产酶的影响

初始pH对菌株M5产酶的影响见图5。由图5可知，CMC酶活随着初始pH的增加表现出先升高后降低的趋势，在初始pH3时达到最高，酶活为7.94 U/mL；滤纸酶活随着初始pH的增加表现出先升高后降低的趋势，在初始pH4时达到最高，酶活为3.24 U/mL。而初始pH为3时，滤纸酶活为3.03 U/mL，酶活仅相差0.21 U/mL，确定最佳初始pH为3。

图5 初始pH值对菌株M5产酶的影响Fig.5 Effect of initial pH value on enzyme production of strain M5

2.4.4 碳源对菌株M5产酶的影响

在发酵培养基的基础上，探究10 g/L碳源对菌株M5产酶的影响，结果见图6。由图6可知，当碳源为酒糟时，CMC和滤纸酶活均最高，分别为7.33 U/mL和2.62 U/mL，当碳源为CMC、滤纸、稻壳、葡萄糖、玉米粉时，酶活依次降低。所以选择酒糟作为碳源。

图6 碳源对菌株M5产酶的影响Fig.6 Effects of carbon sources on enzyme production of strain M5

2.4.5 氮源对菌株M5产酶的影响

以酒糟为碳源，探究5 g/L氮源对菌株M5产酶的影响，结果见图7。由图7可知，氮源为牛肉膏时酶活最高，CMC酶活为9.17 U/mL，滤纸酶活为3.50 U/mL。所以选择牛肉膏为氮源。

图7 氮源对菌株M5产酶的影响Fig.7 Effect of nitrogen sources on enzyme production of strain M5

2.5 菌株M5产纤维素酶的最佳反应温度

反应温度对菌株M5产纤维素酶酶活性的影响见图8。由图8可知，随着反应温度的升高，CMC酶活和滤纸酶活出现先增加后降低的趋势，在55 ℃时酶活最高，分别为13.07 U/mL和5.35 U/mL，说明该纤维素酶最佳反应温度为55 ℃。

图8 温度对菌株M5产酶稳定性的影响Fig.8 Effect of temperature on enzyme production of strain M5

3 讨论

酿酒主要是把粮食中的淀粉经酵母等微生物发酵转化为醇、脂、酸、酮等物质的过程，而其中的粗纤维、脂肪、蛋白质等物质会被保留下来[19-20]，所以酒糟的营养成分是十分丰富的，具有广阔的开发利用价值。随着酿酒产业的工业化发展，酒糟的产量也随之增加，酒糟作为副产品如果能够充分的利用，一定会带来巨大的经济效益和社会效益[21]。目前对酒糟的处理主要是用作动物饲料，但纤维素含量高，添加量低，如果控制不好量，容易致死[22]。因此，如何提高酒糟的综合营养价值，开发出高效、安全、可利用性高的酒糟是解决问题的关键。

其次，筛选出高效的纤维素降解菌也是制约酒糟资源再利用的关键。前人对纤维素降解菌的研究已有很多的报道，研究较多的是真菌和部分细菌[23-24]。陈英连等[25]利用紫外和甲基磺酸乙酯对绿色木霉进行交替诱变，成功筛选到了一株产酶活性较高的菌株，经培养基条件优化后其纤维素酶活和滤纸酶活分别达到22.5 U/mL和2.52 U/mL；吴静[26]从腐质果屑中筛选出一株青霉属的菌株，经条件优化后其滤纸和CMC酶活分别为（3.15±0.12）U/mL和（2.23±0.07）U/mL。本研究从松针腐质土中分离筛选到的菌株M5，耐酸耐低温，在发酵温度20 ℃、初始pH 3时酶活较高，纤维素酶活为9.17 U/mL，能很好的弥补棘孢木霉纤维素降解菌的研究空缺，在白酒糟纤维素降解中拥有广阔的应用前景。

4 结论

本试验从松针腐殖土壤中分离筛选出一株CMC-Na酶活和滤纸酶活均较高的菌株，经形态观察及分子生物学鉴定为棘孢木霉（Trichoderma asperellum），该菌株在发酵温度20 ℃、初始pH值为3、酒糟为碳源、牛肉膏为氮源、发酵5 d的条件下，菌株M5的CMC酶活和滤纸酶活分别为9.17 U/mL和3.50 U/mL；菌株M5所产纤维素酶的最适反应温度为55 ℃。本研究为酒糟的利用提供了重要的理论依据，缓解饲料短缺问题，同时减少环境污染。