芽孢杆菌的产酶特性及其对抗生素的耐受性

谢全喜，侯楠楠，鹿晓慧，曹 斌，崔海英，谷 巍

（山东宝来利来生物工程股份有限公司 山东省动物微生态制剂重点实验室，山东 泰安 271000）

益生菌是指摄入足够的剂量时可以对宿主产生有益影响的活的微生物。目前，益生菌已被广泛应用在动物营养与饲料等行业中，通过动物采食，益生菌进入机体肠道并有效保持胃肠道的微生态平衡，同时，具有促消化、提免疫及分泌产生一些维生素类物质供肠道吸收等功能[1-3]。芽孢杆菌属（Bacillussp.）能够促生长，增殖有益微生物，维持畜禽健康。目前，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）等芽孢杆菌可作为饲料添加剂应用在畜禽养殖中[4]。

芽孢杆菌是一类好氧或兼性厌氧并能够产生具有抗逆性的内生孢子的杆状细菌[5]，作为农业部允许添加的益生菌之一，具有耐高温、耐酸碱、易培养、耐贮藏和加工损失少等特点[6]，在微生态制剂和发酵饲料上得到广泛应用。与其他益生菌相比，芽孢杆菌的热稳定性和在低pH值下生存的能力具有很大优势[7]。研究表明，芽孢杆菌在饲料发酵过程中或在动物消化道内能够分泌多种酶类，包括蛋白酶、纤维素酶、果胶酶等，这些酶类能将饲料中无法吸收的抗营养物质分解成小分子物质，提高饲料利用率，促进畜禽的消化吸收[8]。REIS M P等[9]报道指出，日粮添加枯草芽孢杆菌能够有效促进肉鸡对干物质、粗蛋白的消化吸收，提高饲料效率。另外，芽孢杆菌自身能够分泌具有较强活性的蛋白酶和淀粉酶[10]，因其高产蛋白酶活性而被广泛应用于改善饲料品质[11-12]，据不完全统计，来源于芽孢杆菌的酶制剂占整个酶市场的50%，其中应用最广的是蛋白酶[13]。卢超等[14]研究发现，枯草芽孢杆菌L07产中性蛋白酶活性达133.42 U/mL；令利军等[15]研究发现，地衣芽孢杆菌TG116高产碱性蛋白酶，且具有良好的温度和pH值稳定性。但目前益生菌在应用过程中容易受到抗生素的影响，对益生菌的功能产生影响，因此，有必要对益生菌对抗生素的耐药性展开研究。

本研究以4株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和2株地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）为研究对象，通过测定其成胞率、中性蛋白酶活性及对24种抗生素的耐受性，扩展芽孢杆菌的益生理论，为芽孢杆菌的生产及科研提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株

4株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）（编号BLCC1-0155、BLCC1-0442、BLCC1-0552和BLCC1-0615）、2株地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）（编号BLCC1-0441和BLCC1-0588）：山东宝来利来生物工程股份有限公司。

1.1.2 培养基

芽孢杆菌培养基[8]：蛋白胨10.0 g/L，酵母膏5.0 g/L，氯化钠5.0 g/L，pH值7.0，固体培养基需要加15.0 g/L琼脂粉，121 ℃高压蒸汽灭菌30 min。

1.1.3 试剂

大环内酯类（红霉素、罗红霉素和克拉霉素）、β-内酰胺类（青霉素、阿莫西林、氨苄西林、头孢曲松、头孢噻肟和美罗培南）、喹诺酮类（环丙沙星、左氟沙星、诺氟沙星和恩诺沙星）、氨基糖苷类（链霉素、庆大霉素、卡那霉素、新霉素和大观霉素）、糖肽类（万古霉素）、四环素类（四环素和强力霉素）、氯霉素类（氯霉素）、林可酰胺类（林可霉素）和磺胺类（甲氧嘧啶）共24种药敏纸片：杭州滨和微生物试剂有限公司；蛋白胨（生化试剂）：北京奥博星生物技术有限责任公司；酵母膏（生化试剂）：天津市英博生化试剂有限公司；氯化钠（分析纯）：天津博迪化工股份有限公司。其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

DHP-9082电热恒温培养箱：上海一恒科技有限公司；THZ-C恒温振荡器：扬州培英实验仪器有限公司；HH-4数显恒温水浴锅：常州国华电器有限公司；SW-CJ-2F（2）超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 成胞率的检测

将6株芽孢杆菌冻干粉分别接种于芽孢杆菌固体培养基上，37 ℃条件下培养24 h。将培养好的斜面，在无菌条件下用接种环接2环于芽孢杆菌液体培养基中，37 ℃、180 r/min条件下培养24 h作为种子液，备用。

无菌条件下用接种环蘸取一环培养好的菌液进行革兰氏染色，菌体被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌（G+），被染成红色的是革兰氏阴性菌（G-）。根据油镜下镜检结果判断芽孢杆菌形成脱落芽孢的数量，计算其成胞率，其计算公式如下：

1.3.2 中性蛋白酶活性的检测

发酵玉米-豆粕型常规饲料的制备[8]：采用生料发酵。称取一定量的玉米-豆粕型常规饲料于1 000 mL三角瓶中，料水比为1.0∶0.4（g∶mL），装料量为100 g/瓶，按2.0%接种量分别接入1.3.1培养好的芽孢杆菌种子液，每个样品设3个平行，均置于37 ℃培养箱进行需氧固体发酵，分别于发酵12 h、24 h、36 h和48 h取样检测中性蛋白酶活性。

液体发酵24 h产中性蛋白酶活性和固体发酵玉米-豆粕型常规饲料产中性蛋白酶活性检测均参考国标GB/T 28715—2012《饲料添加剂酸性、中性蛋白酶活力的测定分光光度法》。

1.3.3 芽孢杆菌对抗生素耐受性的检测

采用药敏纸片扩散法检测芽孢杆菌对24种抗生素的敏感性[16]。具体步骤：用无菌生理盐水稀释待检菌株的24 h培养液至菌体浓度为108CFU/mL，取1 mL稀释菌液分别加入平皿中，加入15 mL芽孢杆菌固体培养基，迅速摇匀放置待平板凝固后，将药敏纸片平放于培养基上，静置20 min后，倒置于37 ℃培养箱中培养24 h，用精确至1 mm的直尺测量并记录抑菌圈直径，每种抗生素设3个平行，结果取3次平均值。目前，关于芽孢杆菌对抗生素的耐药性还没有一个统一标准，抗性判定参照美国临床和实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）手册进行[17]，判定标准见表1。表1中未列出的抗生素均按以下标准进行判定：抑菌圈直径≤15 mm为耐药（R）；16～19 mm为中介（I）；抑菌圈直径≥20 mm为敏感（S）。同时计算耐药率，其计算公式如下：

表1 菌株对部分抗生素耐药判断标准Table 1 Evaluation criteria of strain tolerance to some antibiotics

续表

1.3.4 数据处理与分析

试验数据用Excel 2019处理后，采用SPSS 20.0软件的ANOVA程序进行显著性分析，用Fisher氏最小显著差检验（Fisher's least significant difference，LSD）法进行多重比较，以P＜0.05为差异显著性判断标准。测定结果以“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 6株芽孢杆菌芽孢的形成情况

6株芽孢杆菌液体发酵24 h后进行镜检，结果见图1，成胞率见表2。

图1 6株芽孢杆菌发酵24 h镜检结果Fig.1 Microscopic results of 6 strains of Bacillus after fermentation for 24 h

表2 6株芽孢杆菌发酵24 h的成胞率Table 2 Cell formation rate of 6 strains of Bacillus after fermentation for 24 h

由图1及表2可知，菌株BLCC1-0552、BLCC1-0615和BLCC1-0441的成胞率较高，均为98%及以上，几乎全部成胞，只有个别菌体存在；菌株BLCC1-0155次之，成胞率为80.67%；菌株BLCC1-0588成胞率为50.50%，但有较多死菌体存在；菌株BLCC1-0442成胞率最低，肉眼无可见脱落芽孢。芽孢杆菌由于其芽孢具有良好的抗逆性，能耐受工业生产中的高温高压等不利环境，采用芽孢的形式能高效率、低成本地生产高活性、高密度的芽孢杆菌制剂。

2.2 6株芽孢杆菌发酵液中中性蛋白酶活性检测结果

6株芽孢杆菌液体发酵24 h后测定中性蛋白酶活力，结果见表3。

表3 6株芽孢杆菌发酵24 h中性蛋白酶活性检测结果Table 3 Determination results of neutral protease activity produced by 6 strains of Bacillus after fermentation for 24 h

由表3可知，菌株BLCC1-0615产中性蛋白酶活力最高，为100.32 U/mL；其次是菌株BLCC1-0552，产中性蛋白酶活力为90.58 U/mL；菌株BLCC1-0441产中性蛋白酶活力为24.72 U/mL，其他菌株产中性蛋白酶活力较低。在成胞率相同的情况下，地衣芽孢杆菌产中性蛋白酶活能力低于枯草芽孢杆菌。

2.3 6株芽孢杆菌固体发酵玉米-豆粕型常规饲料产中性蛋白酶活性检测结果

6株芽孢杆菌固体发酵玉米-豆粕型常规饲料产中性蛋白酶活性结果见表4。

表4 6株芽孢杆菌固体发酵玉米-豆粕型常规饲料产中性蛋白酶活性检测结果Table 4 Determination results of neutral protease activity of corn-soybean meal type conventional feed produced by 6 strains of Bacillus by solid-state fermentation

由表4可知，6株芽孢杆菌固体发酵玉米-豆粕型常规饲料产中性蛋白酶活力以菌株BLCC1-0615最高，发酵48 h时达到2 154.49 U/g，其次是菌株BLCC1-0552和BLCC1-0441。结合成胞率和中性蛋白酶活力测定结果，选用枯草芽孢杆菌BLCC1-0615、BLCC1-0552和地衣芽孢杆菌BLCC1-0441进行抗生素耐受性研究。

2.4 芽孢杆菌对抗生素耐受性结果

3株芽孢杆菌对24种抗生素的耐受性试验结果见表5。

表5 3株芽孢杆菌药敏试验结果Table 5 Susceptibility tests results of 3 strains of Bacillus

2.4.1 芽孢杆菌对大环内酯类抗生素的耐受性

3株芽孢杆菌对大环内酯类抗生素的耐受性见表6。

表6 3株芽孢杆菌对大环内酯类抗生素耐受性的测定结果Table 6 Determination results of tolerance of 3 strains of Bacillus to macrolide antibiotics

大环内酯类抗生素是指化学结构中含有内酯环的一大类抗生素，主要通过阻断50S亚基23S rRNA内部的肽酰胺转移酶的活性来抑制细菌蛋白质合成，对革兰氏阳性菌和阴性菌都有抑菌性[18]。由表6可知，枯草芽孢杆菌BLCC1-0552和BLCC1-0615对大环内酯类抗生素表现敏感（S），地衣芽孢杆菌BLCC1-0441对大环内酯类抗生素表现耐药（R），两种类型芽孢杆菌对大环内酯类抗生素耐药性不同。

2.4.2 芽孢杆菌对β-内酰胺类抗生素的耐受性

3株芽孢杆菌对β-内酰胺类抗生素的耐受性见表7。

表7 3株芽孢杆菌对β-内酰胺类抗生素耐受性的测定结果Table 7 Determination results of tolerance of 3 Bacillus strains to β-lactam antibiotics

β-内酰胺类抗生素是指结构中含有β-内酰胺环的一类抗生素，通过抑制细菌细胞壁中肽聚糖的形成而使细胞壁破损，水分渗入胞浆导致细菌菌体肿胀、变形、破裂溶解至死亡[19]。是现有抗生素中使用最广泛的一类，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有抑菌性。临床药用频率较高的有青霉素类、头孢菌素类和碳青霉烯类等。由表7可知，被试3株芽孢杆菌对青霉素类（青霉素、阿莫西林和氨苄西林）和碳青霉烯类抗生素（美罗培南）耐药性一致，分别为耐药型（R）和敏感型（S）；而对头孢菌素类抗生素（头孢曲松和头孢噻肟）耐药性不一致，枯草芽孢杆菌BLCC1-0552和BLCC1-0615表现为敏感型（S），地衣芽孢杆菌BLCC1-0441表现为中介型耐药（I）。

2.4.3 芽孢杆菌对四环素类抗生素的耐受性

3株芽孢杆菌对四环素类抗生素的耐受性见表8。

表8 3株芽孢杆菌对四环素类抗生素耐受性的测定结果Table 8 Determination results of tolerance of 3 Bacillus strains to tetracycline antibiotics

四环素类抗生素由放线菌属产生或半合成的一类光谱抗生素，广泛应用于革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、细胞内支原体、衣原体和立克次氏体引起的感染[20]。该类抗生素价格低廉、应用方便、抗菌谱广，被广泛用作饲料添加剂应用在畜禽和水产养殖业中[21]。主要通过与细菌胞内核糖体30S亚单位结合，这种有约束力的结合阻断氨基酰基-tRNA的对接，从而抑制细菌蛋白质合成，起到抗菌效果[22]。由表8可知，3株被试芽孢杆菌对四环素类抗生素耐药型不一致，但均没有表现为耐药型（R）。

2.4.4 芽孢杆菌对喹诺酮类抗生素的耐受性

3株芽孢杆菌对喹诺酮类抗生素的耐受性见表9。

表9 3株芽孢杆菌对喹诺酮类抗生素耐受性的测定结果Table 9 Determination results of tolerance of 3 Bacillus strains to quinolone antibiotics

在细菌细胞内，喹诺酮类药物的作用靶位是脱氧核糖核酸旋转酶和拓扑异构酶Ⅳ[23]，主要通过抑制其酶活性最终抑制脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）合成而发挥抗菌作用。喹诺酮类抗生素主要作用于革兰氏阴性菌，对革兰氏阳性菌作用较弱[24]。由表9可知，3株被试芽孢杆菌对喹诺酮类抗生素耐药型一致，表现为敏感型（S），与芽孢杆菌属于革兰氏阳性菌，喹诺酮类抗生素对其抑菌作用较弱相一致。

2.4.5 芽孢杆菌对氨基糖苷类抗生素的耐受性

3株芽孢杆菌对氨基糖苷类抗生素的耐受性见表10。

表10 3株芽孢杆菌对氨基糖苷类抗生素耐受性的测定结果Table 10 Determination results of tolerance of 3 strains of Bacillus to aminoglycoside antibiotics

由表10可知，3株芽孢杆菌对氨基糖苷类抗生素具有不同程度的耐药性。对庆大霉素和卡那霉素耐受性结果一致，均表现为敏感型（S）；对新霉素和大观霉素耐受性结果一致，均表现为中介型（I）；对链霉素耐受性结果不一致，其中枯草芽孢杆菌BLCC1-0552表现为中介型（I），枯草芽孢杆菌BLCC1-0615和地衣芽孢BLCC1-0441表现为敏感型（S）。氨基糖苷类抗生素主要通过抑制一个或多个参与核糖体翻译的生化步骤来抑制细菌细胞生长，通过与细菌30S核糖体亚基结合，抑制细菌蛋白质合成，从而达到杀菌作用[25]。主要对革兰氏阴性菌有很强的杀菌作用，抗菌效果明显[26]。但随之产生的耐药问题也日趋严重，细菌对其耐药机制主要有氨基糖苷类修饰酶对抗生素的修饰作用，细菌靶位修饰及药物的主动外排[27]。但革兰氏阳性菌芽孢杆菌对氨基糖苷类抗生素中的新霉素、大观霉素和链霉素表现中介型耐药，具有一定的耐受性，其抑菌机理有待进一步研究。

2.4.6 芽孢杆菌对其他抗生素的耐受性

3株芽孢杆菌对其他抗生素的耐受性见表11。

表11 3株芽孢杆菌对其他抗生素耐受性的测定结果Table 11 Determination results of tolerance of 3 Bacillus strains to other antibiotics

由表11可知，3株被试芽孢杆菌对万古霉素和林可霉素耐药型一致，分别表现为敏感型（S）和耐药型（R）；对氯霉素和甲氧嘧啶耐药型不一致，其中2株枯草芽孢杆菌表现为敏感型（S）和耐药型（R），地衣芽孢杆菌BLCC1-0441表现为中介型（I）和敏感型（S）。

2.5 芽孢杆菌对24种抗生素耐药性的统计结果

3株芽孢杆菌对24种抗生素的耐受性统计结果见表12。

表12 3株芽孢杆菌对24种抗生素耐药性统计结果Table 12 Statistical results of tolerance of 3 strains of Bacillus to 24 antibiotics

由表12可知，枯草芽孢杆菌BLCC1-0552和BLCC1-0615的耐药率均为20.83%，低于地衣芽孢杆菌BLCC1-0441（29.17%）。其中枯草芽孢杆菌BLCC1-0552和BLCC1-0615对青霉素类（青霉素、阿莫西林和氨苄西林）、甲氧嘧啶和林可霉素共5种抗生素具有耐药性；地衣芽孢杆菌BLCC1-0441对大环内酯类（红霉素、罗红霉素和克拉霉素）、青霉素类（青霉素、阿莫西林和氨苄西林）和林可霉素共7种抗生素具有耐药性，说明两种类型芽孢杆菌对抗生素耐药性不完全一致。

3株芽孢杆菌中对24种抗生素敏感率最高的是枯草芽孢杆菌BLCC1-0615，敏感率为70.83%，对氨基糖苷类（链霉素、庆大霉素和卡那霉素）、大环内酯类（红霉素、罗红霉素和克拉霉素）、头孢菌素类（头孢曲松和头孢噻肟）、碳青霉烯类（美罗培南）、喹诺酮类（环丙沙星、左氟沙星、诺氟沙星和恩诺沙星）、四环素类（四环素和强力霉素）、氯霉素类（氯霉素）和糖肽类（万古霉素）共17种抗生素表现敏感；其次是枯草芽孢杆菌BLCC1-0552，敏感率为62.50%；敏感率最低的是地衣芽孢杆菌BLCC1-0441，为41.67%。

3 结论

6株芽孢杆菌中枯草芽孢杆菌BLCC1-0552、BLCC1-0615和地衣芽孢杆菌BLCC1-0441发酵24 h后成胞率较高，均达到98%；液体发酵24 h后产中性蛋白酶活性较高，分别为89.94 U/mL、99.32 U/mL和25.40 U/mL；枯草芽孢杆菌BLCC1-0615固体发酵玉米-豆粕型常规饲料产中性蛋白酶最高，发酵48 h时达到2 290 U/g；枯草芽孢杆菌BLCC1-0615对24种抗生素中的17种表现敏感，敏感率最高为70.83%。综合比较，表现较高成胞率、产中性蛋白酶能力及对抗生素较低耐受性的菌株为枯草芽孢杆菌BLCC1-0615，该菌株具有作为饲料添加剂应用于畜禽饲料中的潜力。