蛋白激酶CβⅡ通过IL-6自分泌途径促进肝细胞癌侵袭的研究

刘 敏，陈添亮，郭 娟，伊 雪，高洪泉，巫佳翠，王玉孝

1.厦门医学院基础医学部，福建 厦门 361023；2.机能与临床转化福建省高等学校重点实验室，福建 厦门 361023；3.厦门医学院临床医学系，福建 厦门 361023；4.厦门医学院附属第二医院病理科，福建 厦门 361023

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球第七大高发和第四大致死性的恶性肿 瘤［1］，中国是HCC大国，世界上每年近半数HCC新发和死亡病例均发生在中国［2］，虽然近年来对HCC的基础和临床研究有诸多进展，但HCC患者预后仍然很差，5年生存率仅10%［3］。HCC的复发转移是导致HCC患者死亡率居高不下的主要原因，深入研究其转移的机制，探究更加精确有效的治疗靶点一直是HCC研究的重点和难点。越来越多的证据表明，在HCC发生、发展的过程中，肿瘤微环境与肿瘤细胞的增殖、侵袭及转移密切相关［4］，肿瘤细胞或者肿瘤微环境中的细胞分泌的多种促炎因子、趋化因子等参与肿瘤的转移［5］，尤其是肿瘤细胞源性细胞因子可以通过自分泌途径参与肿瘤的生长、存活及转 移［6］，或通过旁分泌途径重塑基质［7］，促进肿瘤的发展。蛋白激酶CβⅡ（protein kinase CβⅡ，PKCβⅡ）属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶C家族，参与细胞增殖、存活、血管新生等生物学过程，PKCβⅡ在多种肿瘤中表达上调［8-10］，其高表达提示患者预后不良［11］。肺癌细胞高表达PKCβⅡ可以提高细胞的增殖、迁移能力［12］；胃癌中PKCβⅡ的激活参与斯钙素（stanniocalcin-1，STC-1）［13］介导的血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表达，促进胃癌生长及血管新生，上述研究均表明PKCβⅡ在肿瘤的发展过程中发挥重要的作用。我们前期的研究［14］发现，PKCβⅡ通过调控上皮-间质转化介导HCC的转移，然而PKCβⅡ能否通过调节炎性因子参与HCC的侵袭尚不清楚。本文通过研究PKCβⅡ对HCC侵袭的影响及相关机制，探讨PKCβⅡ与肿瘤微环境之间的关系，对深入了解HCC的转移机制、寻找HCC治疗的新靶点具有重要意义。

1 材料和方法

1.1 细胞系及主要试剂

本实验所用到的HCC细胞Huh7和Hep3B购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库/中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，transwell小室（8 μm）购自美国Costar公司，基质胶购自美国BD公司，细胞因子抗体芯片购自美国RayBiotech公司，人白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒、即用型高效免疫组织化学二抗试剂盒购自爱必信（上海）生物科技有限公司，反转录试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，FastStart Essential DNA Green Master购自瑞士Roche公司，IL-6中和抗体、IL-6受体（IL-6 receptor，IL-6R）中和抗体购自美国R&D公司，STAT3和p-STAT3购自美国Cell Signaling Technology公司，PKCβⅡ和IL-6抗体购自美国Abcam公司。

1.2 临床样本

选择2016年5月—2019年12月厦门医学院附属第二医院经病理学检查确诊的HCC患者20例，所有患者均无抗肿瘤治疗史。本研究符合厦门医学院伦理委员会相关规定，患者均自愿参与并签署知情同意书，标本切除后放置于-80 ℃冰箱保存。

1.3 实验方法

1.3.1 构建稳定高表达PKCβⅡ的HCC细胞株

将携带人PKCβⅡ基因的pLVX-puro-表达载体与pMDLg、pVSV-G、pRSV-Rev包装质粒在HEK-293T细胞中进行病毒包装，空载体作为对照组。将HCC细胞接种于2 cm细胞培养皿中，细胞密度40%～50%，第2天换液，加入终浓度为 5 mg/L的聚凝胺（polybrene），病毒冰上融化后滴加到培养液内，混匀，8～12 h后换液继续培养，以1∶5～1∶3的比例进行细胞传代，培养过夜，使用1 mg/L的嘌呤霉素（puromycin）对细胞进行筛选，2～3周后得到稳定表达细胞。

1.3.2 收集条件培养基

稳定高表达PKCβⅡ的HCC细胞及对照用无血清DMEM培养基培养24 h，收集细胞上清液，于4 ℃ 300×g离心10 min，去除悬浮细胞及碎片，-20 ℃保存。

1.3.3 Transwell侵袭实验

用无血清培养基重悬细胞，每孔5×104个细胞，上室中预先加入按1∶6稀释的基质胶，下室加入完全培养基，培养24 h，PBS洗3次，采用4%多聚甲醛室温固定30 min，PBS洗3次，结晶紫染色30 min，PBS洗3次，棉签擦掉上室内的细胞，显微镜下每组随机选取5个视野进行计数，实验重复3次，每组3个复孔。

1.3.4 细胞因子抗体芯片检测

使用细胞因子抗体芯片Human Inflammation Array C3（美国RayBiotech公司）检测细胞上清液中细胞因子的水平，实验步骤参考厂商提供的方案。简述如下：收集无血清条件培养基，每个芯片孔中加入100 µL的1×封闭液，室温摇床上温育30 min，抽去封闭液，每孔加入100 µL的样品，4 ℃震荡温育过夜，弃去样品，每孔加入 250 µL的1×洗液Ⅰ，清洗6次，每次震荡10 s，每孔加入250 µL的1×洗液Ⅱ，清洗5次，每次震荡10 s，每孔加入70 µL生物素标记抗体（事先用1×封闭液稀释），室温温育1～2 h，洗膜，每孔加入70 µL荧光剂-链霉亲和素（事先用1×封闭液1∶1 500稀释），避光室温震荡温育2 h，洗膜，利用GenePix 4000B Microarray Scanner扫描仪，532 nm激发波长进行扫描，采用AAH-INF-G3的数据分析软件计算各信号点灰度值。

1.3.5 ELISA检测

收集无血清条件培养基，各孔加入100 µL标准品和实验样品，盖上贴膜，室温温育2 h，弃去液体，加入400 µL洗涤液洗涤，重复3次，拍干，每孔加入100 µL IL-6检测抗体，室温温育 2 h，加入400 µL洗涤液洗涤，重复3次，拍干，每孔加入100 µL链霉亲和素-HRP，室温避光温育20 min，加入400 µL洗涤液洗涤，重复3次，拍干，每孔内加入100 µL显色液，室温避光温育 20 min，每孔加入终止液50 µL，终止反应，450 nm波长测量各孔的吸光度（D）值，设定 540 nm作为校正波长。

1.3.6 实时荧光定量聚合酶链反应（realtime fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）检测

将稳定高表达PKCβⅡ的HCC细胞及对照细胞提取总RNA，采用反转录试剂盒将等量RNA（2 μg）反转录成cDNA，应用Light Cycler 96 RTFQ-PCR仪，使用SYBR GreenⅠ嵌合荧光法，以比较CT值法（2-ΔΔCT法）计 算相对定量。所用到的引物序列I L-6 有义链为AGACAGCCACTCACCTCTTCAG，反义链为TTCTGCCAGTGCCTCTTTGCTG；I L-6R有义链为GACTGTGCACTTGCTGGTGGAT，反义链为ACTTCCTCACCAAGAGCACAGC；GAPDH有义链为5’-GTCAAGGCTGAGAACGGGAA-3’，反义链为5’-AAATGAGCCCCAGCCTTCTC-3’。预温育95 ℃ 600 s，循环条件95 ℃ 10 s，57 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，共45个循环，溶解95 ℃ 10 s，65 ℃ 60 s，97 ℃ 1 s。

1.3.7 抗体中和实验

对数生长期的细胞加入I L-6 中和抗体（5 μg/mL）或IL-6R中和抗体（5 μg/mL）预处理1 h，PBS洗3次，胰酶消化，无血清培养基重悬，用于细胞侵袭实验。

1.3.8 蛋白质印迹法（Western blot）检测

细胞用冷PBS洗3 次，加入十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）裂解液，提取细胞总蛋白，用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）试剂盒进行蛋白定量。每组取等量蛋白用10%SDS-PAGE分离蛋白后，以湿转法转移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，加入5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入一抗4 ℃温育过夜，TBST洗膜后，加入辣根过氧化物酶标记的对应二抗，室温温育1 h，滴加电化学发光（electrochemical luminescence，ECL）显影液显影。以GAPDH作为内参。

1.3.9 免疫组织化学法检测

取临床HCC患者癌组织石蜡切片，按照试剂盒说明书进行免疫组织化学染色，DAB工作液显色，苏木精复染，盐酸乙醇分化、脱水，中性树脂封片。光学显微镜观察PKCβⅡ、IL-6的表达情况。为了进行PKCβⅡ和IL-6的相关性分析，本研究以免疫组织化学染色评分反映PKCβⅡ和IL-6的表达水平，免疫组织化学染色评分=染色强度×阳性细胞比例（%）。染色强度评分标准：不着色，0分；黄色，1分；棕黄色，2分；棕褐色，3分；阳性细胞所占观察细胞百分比评分标准：＜5%，0分；5%～25%，1分；26%～50%，2分；51%～75%，3分；＞75%，4分。

1.4 统计学处理

所有统计学分析均采用SPSS 22.0软件进行，结果以表示，实验两组间比较采用两个独立样本的t检验分析，方差齐且服从正态分布的组间差异采用单因素方差分析，PKCβⅡ和IL-6表达的相关性分析采用非参数Spearman检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PKCβⅡ高表达细胞的条件培养基增强HCC细胞的侵袭能力

本研究采用取自PKCβⅡ稳定高表达HCC细胞组和对照组细胞的条件培养基（conditioned medium，CM）处理HCC细胞Huh7和Hep3B 24 h，通过transwell法检测细胞侵袭能力的变化。结果显示，与来自对照组的条件培养基比较，PKCβⅡ高表达细胞的条件培养基能够显著增强Huh7的侵袭能力（P＜0.01，图1A）；在HCC细胞Hep3B中，PKCβⅡ高表达细胞的条件培养基同样能够增强细胞的侵袭能力（P＜0.05，图1B）。上述结果表明，自分泌途径可能参与了PKCβⅡ的促HCC侵袭作用。

图1 PKCβⅡ高表达细胞的条件培养基提高HCC细胞的侵袭能力Fig.1 Conditioned medium from PKCβⅡ-overexpressing cells promoted the invasion of HCC cells

2.2 PKCβⅡ促进IL-6的分泌

采用细胞因子抗体芯片检测PKCβⅡ高表达组和对照组细胞因子分泌的变化，将PKCβⅡ高表达前后细胞因子的相对量进行比较，结果显示，在表达水平提高的细胞因子中，IL-6的提高最为显著（图2A）。ELISA结果显示，在HCC细胞Hep3B中高表达PKCβⅡ可以提高上清液中IL-6的含量（P＜0.01，图2B），在HCC细胞Huh7中高表达PKCβⅡ也观察到了类似的结果（P＜0.01，图2B）；RTFQ-PCR结果显示，在HCC细胞Hep3B中高表达PKCβⅡ可以上调IL-6的转录（P＜0.01，图2C），在HCC细胞Huh7中高表达PKCβⅡ也观察到了类似的结果（P＜0.01，图2C）。上述结果表明，PKCβⅡ可以促进IL-6的分泌。

图2 PKCβⅡ促进IL-6的分泌 Fig.2 PKCβⅡ promoted IL-6 secretion

2.3 PKCβⅡ通过IL-6自分泌方式介导HCC细胞的侵袭

为了验证IL-6是否参与PKCβⅡ的促HCC侵袭作用，抗体中和实验结果显示，IL-6中和抗体可以抑制HCC细胞Huh7的侵袭能力（P＜0.05，图3A），而对PKCβⅡ高表达的Huh7细胞，IL-6中和抗体可以更加明显地抑制其侵袭能力（P＜0.01，图3A）；在HCC细胞Hep3B中，IL-6中和抗体对其侵袭能力有所抑制，但差异并无统计学意义（P＞0.05，图3B），而对PKCβⅡ高表达的Hep3B细胞，IL-6中和抗体可以抑制其侵袭能力的增强（P＜0.01，图3B）。上述结果表明，PKCβⅡ介导HCC细胞侵袭能力的增强是通过IL-6自分泌方式实现的。

图3 PKCβⅡ通过IL-6自分泌方式介导HCC细胞的侵袭Fig.3 PKCβⅡ promoted the invasion of HCC cells by modulating the autocrine of IL-6 in vitro

2.4 IL-6/STAT3信号通路参与PKCβⅡ的促HCC细胞侵袭

通过RTFQ-PCR检测PKCβⅡ高表达HCC细胞Huh7和对照组细胞中IL-6受体的表达，结果表明，PKCβⅡ可以提高IL-6受体的转录（P＜0.01，图4A）；抗体中和实验的结果显示，IL-6受体中和抗体可以抑制HCC细胞Huh7的侵袭能力（P＜0.05，图4B），而对PKCβⅡ高表达的Huh7细胞，IL-6受体中和抗体可以显著抑制其侵袭能力（P＜0.01，图4B）；通过Western blot检测p-STAT3的表达，高表达PKCβⅡ可以上调STAT3的磷酸化（P＜0.05，图4C），加入IL-6受体中和抗体即可以抑制对照组STAT3的磷酸化（P＜0.05，图4C），又可以抑制高表达PKCβⅡ介导的STAT3磷酸化上调（P＜0.01，图4C）。上述结果表明，IL-6/STAT3信号通路参与PKCβⅡ的促HCC细胞侵袭。

图4 IL-6/STAT3信号通路参与了PKCβⅡ的促HCC细胞侵袭Fig.4 IL-6/STAT3 signal pathway played a role in the invasion of HCC cells by PKCβⅡ

2.5 HCC临床样本中PKCβⅡ与IL-6表达的相关性分析

通过免疫组织化学法观察临床HCC患者样本中PKCβⅡ和IL-6表达的相关性。相同标本的连续切片染色反映PKCβⅡ和IL-6表达的正相关性，即随着PKCβⅡ表达的增加，IL-6的表达也增加（图5A）；通过比较PKCβⅡ与IL-6的免疫组织化学评分，两者的表达呈正相关（相关系数r=0.697，P＜0.01，图5B）。

图5 HCC临床样本中PKCβⅡ与IL-6表达的相关性分析Fig.5 Correlation of PKCβⅡ with the expression of IL-6 in clinical HCC cases

3 讨 论

HCC的炎性微环境与HCC的进程是互相促进、交织共存的。在肿瘤的发展过程中，包括肿瘤细胞在内的多种细胞通过释放细胞因子，如IL-6、白细胞介素-8（interleukin-8，IL-8）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor α，TNF-α）以及花生四烯酸类物质等组成肿瘤的炎性微环境，参与肿瘤的增殖、侵袭和血管生成等［15］。本研究发现，PKCβⅡ通过IL-6自分泌途径促进HCC的侵袭，提示PKCβⅡ表达失调可以通过炎症性因子自分泌方式参与HCC的发展过程，揭示了PKCβⅡ调控HCC转移的新机制，为PKCβⅡ调控肿瘤微环境参与HCC发生、发展提供了依据。

我们前期的研究结果发现，高表达PKCβⅡ可以增强HCC细胞的迁移、侵袭能力［14］，本研究收集PKCβⅡ高表达HCC细胞的条件培养基处理HCC细胞，可以增强细胞的侵袭能力，提示PKCβⅡ促HCC侵袭的能力也可能有自分泌细胞因子的参与。随后，应用细胞因子抗体芯片技术检测PKCβⅡ高表达后细胞因子分泌的变化，结果表明，IL-6升高最显著，普遍上调的促炎因子还包括IL-8、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）、粒细胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）以及干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）等，由此可见，PKCβⅡ促进HCC细胞产生多种促炎因子，招募炎症细胞，参与构成肿瘤炎症微环境，促进HCC的发展。

在各种炎性因子中，IL-6被认为是衔接炎症与肿瘤最核心的因子［16］，在结肠癌［17］、乳腺癌［18］等肿瘤组织及患者血清中均表达升高，其高表达与肿瘤的侵袭及患者的不良预后密切相 关［19］。抗体芯片检测结果表明，PKCβⅡ高表达可以提高IL-6水平至对照组的11倍，ELISA检测也发现，PKCβⅡ高表达可以在Huh7和Hep3B中显著提高上清液中IL-6的水平，RTFQ-PCR也得到相同的结果，提示PKCβⅡ高表达后IL-6从转录到分泌水平都明显增强。关于PKCβⅡ调控IL-6转录的分子机制，本研究没有深入探究，这是本实验的不足之处。核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）是对炎症因子具有广泛调节作用的转录因子，静息状态下，NF-κB与其抑制剂IκB结合以无活性形式存在于细胞质中，激活后的NF-κB转位入细胞核，可以与IL-6启动子中的κB序列结合，调控IL-6的转录［20］，同时有研究报道PKCβⅡ可以通过经典信号通路激活 NF-κB［21］，促进慢性淋巴细胞白血病细胞的存活。因此，我们推测PKCβⅡ对IL-6转录和分泌的调控可能与NF-κB信号通路有关。

接着我们用IL-6中和抗体预处理HCC细胞，发现可以抑制PKCβⅡ高表达介导的HCC细胞侵袭能力的增强，表明PKCβⅡ通过IL-6自分泌途径促进HCC细胞的侵袭。IL-6作为肿瘤炎症微环境中的重要成员，通过与IL-6R结合激活不同的信号转导通路，IL-6R在包括肿瘤细胞在内的多种细胞表面表达。本研究发现PKCβⅡ可以提高HCC细胞IL-6R的转录，用IL-6R中和抗体预处理HCC细胞，PKCβⅡ促HCC细胞侵袭的能力减弱。在IL-6激活的信号通路中，JAK/STAT3信号转导通路最重要，IL-6通过与IL6-R结合，引起 STAT3磷酸化并形成二聚体，活化的STAT3二聚体转入细胞核内调控靶基因转录［22］，STAT3信号转导途径的异常与血管形成及肿瘤转移关系密 切［23］，本研究发现高表达PKCβⅡ可以提高STAT3的磷酸化，加入IL-6R中和抗体则降低其磷酸化水平，表明PKCβⅡ通过IL-6/IL-6R/STAT3自分泌途径调控HCC的转移。

随着医疗水平的不断进步，针对 HCC 的治疗也取得了长足的发展，手术切除和肝移植仍是目前治疗HCC的主要手段，但仍有超过50%的患者会在5年内出现术后复发和转移［24］。目前缺少有效针对HCC的靶向治疗药物，索拉非尼是目前临床上治疗晚期HCC的一线靶向治疗药物，通过阻断肿瘤新生血管的形成，抑制肿瘤的转移和侵袭［25］，尽管索拉非尼在晚期HCC的治疗中发挥极为重要的作用，但由于耐药现象的存在限制了其临床应用。因此，研发新型的精准靶向治疗药物，对提高HCC的治疗及患者预后有着重要的意义。本研究发现，PKCβⅡ通过IL-6自分泌途径促进HCC的侵袭，调控肿瘤炎症微环境参与HCC的发展，因此靶向PKCβⅡ有可能成为HCC治疗中有效的辅助治疗策略。