海洋鱼源抗菌肽的研究进展及其在食品 安全中的应用前景

陈 选，陈 旭，韩金志，汪少芸,*

（1.福州大学石油化工学院，福建 福州 350108；2.福州大学生物科学与工程学院，福建 福州 350108）

抗生素的过度使用会导致许多病原微生物对几乎所有的药物都产生不同程度的耐药性，这成为我国畜牧业、水产养殖业及食品工业领域可持续发展的桎梏[1-2]。因此，发展新型的“抗生素替代物”势在必行。抗菌肽被誉为“天然抗生素”，是生物体内普遍存在并具有广谱抗微生物活性的小分子多肽，是天然免疫系统的重要组成部分，其在防御病原微生物中发挥着重要作用[3-5]。同时，抗菌肽被证实不仅对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌、病毒及肿瘤细胞等有抑制或杀灭作用，而且具有良好的免疫调节生物学功能[6-7]。海洋拥有地球上大约80%的生物资源，生态环境复杂，鱼类作为低等脊椎动物，当其受到损伤或者病原微生物入侵时，将会迅速分泌抗菌肽以作为防御和杀伤入侵物质的非特异性免疫因子[8-10]。因此，从海洋鱼类中发现更多活性丰富的抗菌肽，并探索其在农业、畜牧业及食品工业等领域的应用已成为国内外学者关注的焦点。

本文综述了海洋鱼源抗菌肽的结构、生物活性及作用机制的研究进展，展望了其在食品安全领域的应用前景，以期为海洋鱼源抗菌肽的进一步研究利用提供依据。

1 海洋鱼源抗菌肽的结构

抗菌肽作为海洋鱼类重要的非特异性免疫因子，当鱼类受到损伤或者病原微生物入侵时，其将会被迅速分泌以抵御和杀伤入侵物质[8-9]。通过分析现有鱼源抗菌肽间氨基酸序列的一级结构可知，它们彼此间并未表现出高度的同源性，但存在一些共同特征（如富含较多的疏水性氨基酸，使分子在疏水性环境中折叠成疏水或两亲性的α-螺旋结构；富含赖氨酸或精氨酸而使分子整体带正电荷等[11-12]）。根据海洋鱼源抗菌肽的一级结构和在细胞膜相互作用过程中形成的二级结构特征，主要将其分为3 类[13]：1）不含半胱氨酸但可以折叠成疏水或两亲性的α-螺旋结构（图1A）。此类抗菌肽因为富含某种碱性氨基酸和具有α-螺旋结构，有利于通过在细菌细胞膜中形成穿孔以直接发挥抗菌活性，主要包括Piscidins[14]、Gaduscidins[15]、Moronecidins[16]、Pleurocidin[17-18]、Chrysophsin[19]、Pardaxins[20]及Epinecidin[21]等。2）富含半胱氨酸且能够通过二硫键形成β-折叠结构（图1B），主要包括Cathelicidin[22]、Defensins[23]、Hepcidin[24]等。 3）富含某种特定氨基酸的无规则结构肽，如环状结构抗菌肽（图1C）和伸展类抗菌肽（图1D），主要包括 HPL-1[25]、Parasin I[26]、Oncorhyncin II[27]及Hipposin[28]等组蛋白衍生抗菌肽，此类抗菌肽的一级结构与组蛋白H1、H2A及H2B相似（表1）。近几年，海洋鱼类中富含天冬氨酸和谷氨酸的非阳离子抗菌肽也相继被发现[29-31]，主要包括鲣鱼的SHbAP、大西洋鳕鱼的Piscidin-2、大黄鱼的Lc-NK-lysin等。就抗菌肽结构整体而言，海洋鱼源与陆生动物及两栖动物间不存在明显的差异，因此，相应的抗菌肽结构分类标准同样适用于海洋鱼源。但是，海洋鱼源抗菌肽也存在一些特有的家族结构，如富含组氨酸的Piscidins[14]，其独特的结构信息可为新型“抗生素替代物”的发展提供更多选择。

图 1 海洋鱼源抗菌肽的主要结构[13]Fig. 1 Structures of antimicrobial peptides derived from marine fish[13]

表 1 海洋鱼源主要抗菌肽Table 1 Major antimicrobial peptides derived from marine fish

2 海洋鱼源抗菌肽的生物活性

2.1 抗微生物

海洋鱼源抗菌肽具有抗微生物功能，不仅对金黄色葡萄球菌、粪链球菌、尼氏链球菌、加氏乳球菌、大蒜乳杆菌等革兰氏阳性菌，以及沙门氏气单胞菌、嗜水气单胞菌、溶藻弧菌、大肠杆菌、幽门螺杆菌等革兰氏阴性菌在内的细菌有作用，而且对真菌、病毒和寄生原虫等生物性病原物也有一定的抑制或杀灭作用[9-13,32]。如Bo Jun等[33]通过肝脏转录组学技术从石斑鱼中得到了6 种抗菌肽，包括Hepcidin 1、肝表达抗菌肽2（liver expressed antimicrobial peptide 2，LEAP-2）、Piscidin、Moronecidin、NK-lysin和β-Defensin，通过最低抑菌浓度测定发现，这些合成抗菌肽均具有抗菌活性，其中LEAP-2和Moronecidin的抗菌能力较强，且在5～40 μmol/L范围内无细胞毒性；Raju等[34]从生鱼的Piscidin蛋白中得到了两个抗菌肽CsLC11和CsRG12，并发现它们不仅可以抑制金黄色葡萄球菌和蜡状芽孢杆菌的生长，而且能很好地抑制其生物膜的形成； Joseph等[35]从抗菌肽的最大数据库APD中筛选出6 个对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌具有较强抑制作用的抗菌肽，其中包括海洋鱼源特有的抗菌肽Piscidins，并将其作为抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的候选化合物。从生物进化的角度看，相较于暴露在各种陆生环境中的病原体，海洋鱼类被水生病原体所包围，其形成了专门的防御机制以应对栖息环境所遇到的特定微生物。因此，从海洋鱼源抗菌肽中开发适用于水产养殖业的新型“抗生素替代物”将具有良好的前景[9-10]。

2.2 免疫调节

海洋鱼源抗菌肽在体外具有良好的抗微生物功能，但在血清、盐离子及阴性大分子（如糖胺聚糖）等体内复杂的环境影响下，其抗微生物功能或将受到抑制，此时，抗菌肽可能通过调节宿主的免疫反应来发挥抗微生物功能[36]。以富含抗菌肽的鱼类皮肤为例，当海洋中的鱼类遭受到来自细菌、病毒或其他病原体的化学或机械损伤时，其上皮细胞将开始释放白细胞介素（interleukin，IL）-1β 等细胞因子，嗜中性粒细胞和T细胞聚集至表皮浅层[36-37]。 同时，黏液杯状细胞开始分泌富含多种抗菌肽的黏液，其中Hepcidins等抗菌肽通过免疫调节功能间接发挥对细菌的抵抗作用，而像Piscidins、Pleurocidin、Cathelicidin等抗菌肽则直接发挥抑制细菌的作用[37-38]（图2）。因此，海洋鱼源抗菌肽具有重要的免疫调节功能。

图 2 海洋鱼源抗菌肽的免疫调节机制[38]Fig. 2 Immunomodulatory mechanism of antimicrobial peptides derived from marine fish[38]

2.3 其他生物活性

随着对海洋鱼源抗菌肽研究的逐渐深入，在其抗微生物和免疫调节功能的基础上，发现了其更多的生物学功能。如Chen Wufu等[39]发现在RAW264.7细胞和BV2细胞中，Piscidin-1能够显著抑制促炎蛋白诱导型一氧化氮合成酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）和环氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）的表达上调，具有作为止痛药使用补充治疗的潜力；Ting等[40]发现来自罗非鱼的Piscidin-4能够在线粒体上破坏钙稳态并激活蛋白FosB，FosB的过表达导致了三阴性乳腺癌细胞的死亡，因此Piscidin-4具有抗乳腺癌的潜力；Talandashti等[41]系统地研究了抗菌肽Pleurocidin对不同生物膜的作用特点，及其细菌产生抗性的原因，以期开发出以Pleurocidin为模板对多药耐药菌具有抑制作用的高效抗生素。此外，海洋鱼源抗菌肽还可作为营养活性物质应用于特殊医学用途配方食品。如Mary等[42]发现带正电荷的Piscidin-1能够与初乳或牛奶中带负电荷的酪蛋白分子强烈结合，这种结合使Piscidin-1不被酶降解，并可能在肠道微生物的作用下释放，发挥免疫调节功效。

3 海洋鱼源抗菌肽的作用机制及其特点

3.1 作用机制

海洋鱼源抗菌肽的广谱杀菌作用是目前研究的重点，但是关于其作用机制仍存在争议。有研究表明，抗菌肽是通过与细菌细胞膜发生作用而导致其破坏或 裂解[43]；还有研究表明，抗菌肽与传统的抗生素一样，穿过细胞膜后，通过作用于细菌细胞内的一些物质来阻碍蛋白质及DNA、RNA的合成，破坏折叠结构，导致蛋白质变性[44]；另有研究表明，抗菌肽在亚最低抑菌浓度时，通过与细菌DNA的结合，破坏了细菌的正常生物功能，而超过最小抑菌浓度时，则直接与细胞膜发生作用，导致细菌的破坏或裂解[45]。因此，尽管海洋鱼源抗菌肽的抗菌作用机制存在争议，但其对细胞膜的作用靶标是明确的，且随着显微镜技术、荧光染色技术、离子通道技术、X射线衍射技术和固相核磁共振技术等的成熟及分子动力学等相关理论的完善，抗菌肽以细胞膜为靶标的直接或间接抗菌机制逐渐清晰[46-47]。

3.2 细胞膜作用模型

桶-板模型、地毯模型和曲面-孔道模型是目前研究较多的抗菌肽以细胞膜为靶标的抗菌机制（图3）。

图 3 抗菌肽以细胞膜为靶标的抗菌机制[48]Fig. 3 Mechanism of action of antimicrobial peptides targeting cell membrane[48]

在桶-板模型中，抗菌肽插入细胞膜中，和膜表面呈垂直方式排列，分别形成木桶的侧板及孔道，其中抗菌肽分子中的疏水基团直接由磷脂膜中间插入，亲水部分则面对孔道空腔。该过程是一个动态过程，在第一阶段，抗菌肽以单体形式与膜结合，随着抗菌肽的插入和疏水成分的增加，抗菌肽浓度达到临界值；在第二阶段，抗菌肽的疏水部分与细胞膜的疏水核心互相作用，缓慢进入疏水核心，孔道结构发生改变，失去多肽单体的动力学结构[47-48]。

在地毯模型中，抗菌肽的疏水部分与磷脂双分子层表面平行且并不插入细胞膜中，而是像地毯一样覆盖于膜表面。抗菌肽通过静电作用吸附到众多的阴离子磷酸基团上，改变细胞膜的表面张力，当抗菌肽浓度累积到一定值时，细胞膜表面出现裂孔，导致细胞质外渗，形成微团，抗菌肽渗入[48-50]。如一种鱼胶原蛋白的抗菌肽Collagencin被证明可在疏水性环境中通过二硫键形成β-折叠结构，并通过与脂类形成多个氢键停留在膜-水界面，遵循地毯模型的抗菌机制[51]。需要说明的是，在地毯模型中，细胞膜的崩解并不会导致孔道的形成，在磷脂双层曲率混乱后，细胞膜破裂并形成微团，因此也可将其称为微团模型[52]。

在曲面-孔道模型中，与桶-板模型类似，抗菌肽以垂直于膜的方向插入细胞膜中，形成亲水孔道。同时，肽的疏水区域与脂质核心相结合，亲水面和磷脂头部相结合，脂膜向内弯曲，磷脂头部倾斜，肽的亲水区域与膜层之间疏水区域结合形成孔道表面的垫层，通过螺旋状环由上至下形成连续弯曲的形状[52-53]。具有疏水或两亲性α-螺旋结构的Piscidins家族属于海洋鱼类抗菌肽中典型的曲面-孔道模型作用方式。有研究将具有同源性的Piscidin-1和Piscidin-3（分别在PC/PG和PE/PG的模拟膜环境中）进行动力学计算后发现：Piscidin-1具有更强的杀菌能力可能是通过两个关键氨基酸残基实现的，位于肽N末端2位的苯丙氨酸增强了固定能力和螺旋稳定性，而非极性部分17位的组氨酸则增强了膜变形和变薄能力 （图4）；此外，Piscidin-1对细胞膜的插入更深，与其在完全水合状态下的行为相关，即具有更强的倾斜能力，通过掩埋组氨酸和C末端，导致细胞膜变薄和缺陷，并改变细胞膜的电导率和黏弹性[54-55]。这一发现不仅较清晰地解释了海洋鱼源特有抗菌肽Piscidins的结构与其抗菌机制间的关系，而且也为理解脊椎动物在天然宿主防御机制中的进化提供依据。因为从整体而言，海洋鱼源特有抗菌肽在一定程度上代表了一个进化上较保守的家族[38,48]。

图 4 Piscidin-1和Piscidin-3在不同膜环境中的分子动力学模拟[54]Fig. 4 Molecular dynamics simulation of piscidin-1 and piscidin-3 in different membrane environments[54]

需要说明的是，桶-板模型、地毯模型和曲面-孔道模型并不是绝对割裂的，在抗菌肽对细胞膜的作用过程中可能存在多种作用模型。如Pleurocidin对细胞膜通透性的作用机制可能是通过形成环状孔的“地毯”机制来实现的，即曲面-孔道模型与地毯模型互补[41]；根据作用对象细胞膜成分的不同，作用模型可以是桶-板模型也可以是地毯模型，因为胆固醇的存在能显著降低其C末端两亲性螺旋的骨架运动和倾斜角[56]。同时，将抗菌肽和抗生素联合使用可以实现协同增效，如鱼源抗菌肽Pleurocidin和红霉素联合使用，能够通过羟自由基的形成增加细菌细胞膜的通透性[57]。

3.3 细胞膜的作用特点

抗菌肽对不同生物的细胞膜有选择性差异[58-59]（图5）。对于不同类型的细胞膜，其分子组成是不同的，细菌等原核生物的双层膜结构主要由PE和PG组成，而真核生物——哺乳动物的细胞膜主要由PC和PE等两亲性磷脂组成，而且哺乳动物的细胞膜中还富含胆固醇[60]。 不仅革兰氏阴性菌与革兰氏阳性菌的细胞膜组分不同，而且与真核细胞的膜成分也不同，导致海洋鱼源抗菌肽对原核生物、真核生物有选择性差异[61]。因此，根据抗菌肽对原核细胞膜与真核细胞膜的作用机理差异，可以通过氨基突变的方式调整抗菌肽的带电性、疏水性及两亲性等参数来改变抗菌肽对原核细胞膜与真核细胞膜的选择性，在保证对原核细胞膜破坏的同时，降低对真核生物的毒性。如对于鱼源Piscidins家族的抗菌肽，以一个或两个赖氨酸残基替换疏水面中心的不同位置。这一简单的修饰不仅保持或提高了其对革兰氏阴性杆菌——鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌的抗菌活性，而且显著降低了对人红细胞的溶血活性[62]。

图 5 抗菌肽对不同生物细胞膜的选择性[59]Fig. 5 Selectivity of antimicrobial peptides tocell membranes of different organisms[59]

此外，与抗生素通过干扰细菌的DNA、RNA和蛋白质的合成等机制不同，抗菌肽是直接以细胞膜为靶标，极大地降低细菌产生耐药性的可能。相较于抗生素的抗菌机制，病原体仅需改变一个或少量的基因便可产生耐药性，而对于抗菌肽的抗菌机制，病原体必须改变大量的基因才能实现其耐药性，而大量基因的改变对于病原体基本上是不可能发生的[63]。综上所述，利用海洋鱼源抗菌肽对不同生物细胞膜的选择性差异，可实现其靶向抗菌潜能。更重要的是，相较于传统的抗生素，海洋鱼源抗菌肽还能够极大程度地降低细菌产生耐药性的机率。

4 海洋鱼源抗菌肽在食品安全中的应用

4.1 食物链和食品原料安全

食品产业由农田到餐桌的整个链条上，涉及到的如种植和养殖、生产加工、包装和储藏保鲜及市场流通等各环节都存在食品安全风险因素，各环节的食品安全风险都有可能导致食品安全问题的产生。而传统抗生素在饲料业和养殖业中的滥用，已导致了细菌抗药性、药物残留等严峻食品安全问题[64-65]。其中，食品中的耐药菌不仅可以直接对人类的公共健康构成威胁，而且其所具有的耐药基因可能通过食物链的传播[66]间接地危害人类健康。耐药菌或耐药菌基因主要通过3 种途径出现在食物链中（图6）：1）传统抗生素在农业、饲料业及养殖业中的滥用导致食品原料中出现耐药菌；2）食品加工过程中添加的发酵剂及噬菌体等可能存在耐药基因；3）食品加工过程中存在耐药菌交叉污染[67-68]。因此，日益严重的细菌耐药性威胁已成为制约食品工业可持续 发展的障碍，研发绿色高效的饲料添加剂以代替传统的抗生素己成为共识。抗菌肽独特的抗微生物活性及免疫调节活性，让其成为新型绿色饲料添加剂的潜在选择。如Huang Hanning等[69]将重组表达的罗非鱼抗菌肽Piscidin-4制成颗粒并以0、1%、3%及5%（以正常饲料质量计）的添加量作为补充剂添加至正常饲料中，喂食28 日龄的金目鲈，结果发现喂食3%和5% Piscidin-4的金目鲈在增体质量、存活率和肝指数等方面均有显著提高。Chen等[70]则对饲料中添加的石斑鱼抗菌肽Piscidins进行毒理学实验，通过6 项毒性实验发现，抗菌肽Piscidins对实验动物既没有急性毒性反应，也未表现出致突变性，可作为安全的家禽、牛或水生动物的饲料添加剂。

图 6 食物链中的抗生素耐药性[68]Fig. 6 Antimicrobial resistance in the food chain[68]

4.2 食品包装及储藏保鲜

食源性疾病是指通过摄食进入人体内的各种致病因子引起的，通常具有感染性质或中毒性质的一类疾病[71]。 致病因子以细菌、病毒、真菌和原生动物等生物性病原物种类为主，引起的相关疾病也最为常见，其中细菌是重要诱因，相关的病原菌主要包括沙门氏菌、大肠埃希菌、葡萄球菌、变形杆菌和副溶血性弧菌等[72]。先进的食品包装及储藏保鲜技术是保证食品安全、预防食源性疾病的关键[73-74]。抗菌肽具有高效的抑菌作用及独特的抗菌机制，因此被视为生物保鲜剂和食品包材的重要原料。其中，微生物来源的抗菌肽乳酸链球菌素（nisin）、片球菌抗菌肽及链霉菌抗菌肽等已在食品工业中被广泛应用，如纯天然的食品防腐剂——乳酸链球菌素被直接或作为包材涂料应用于乳制品、罐藏食品、农产品、发酵饮品及肉制品的防腐保鲜中[75-76]。相较于微生物来源的抗菌肽，海洋鱼源抗菌肽具有相似或对某种微生物更高效的抑制效果，因此其在食品的包装及储藏保鲜方面具有广阔的应用前景。

5 结 语

由农田到餐桌的整个食品产业链条上，涉及种植及养殖、生产加工、包装和储藏保鲜及市场流通等 各个环节，每个环节都存在食品安全风险，其中又以因细菌、病毒及真菌等病原微生物引起的食品安全问题最为常见。同时，传统抗生素的过度使用，已经导致了许多病原微生物对几乎所有的药物都产生了不同程度的耐药性。因此，发现天然的“抗生素替代物”并探索其在畜牧业、水产养殖业及食品工业等“菜篮子”领域的安全应用已成为国内外学者持续关注的焦点。海洋鱼源抗菌肽不仅具有对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌、病毒及肿瘤细胞等的抑制或杀灭作用，而且具有良好的免疫调节功能，因此发现更多活性丰富的海洋鱼源抗菌肽，并探索其在食品原料安全、食品包装及储藏保鲜等食品安全领域的应用将具有广阔的前景。值得注意的是，一般天然来源的抗菌肽活性并不高，甚至其中一些对真核细胞存在毒性；因此，为了保证海洋鱼源抗菌肽能够作为合格的“抗生素替代物”，则要对其作用机制及特点进行深入研究，并通过科学的结构优化以提高活性、降低毒性。未来的研究方向可以是：1）通过对海洋鱼类生存策略及环境适应机制的研究来探索防御策略，揭示鱼类适应海洋环境的物质基础与分子机制，并借助基因组文库、cDNA文库、生物信息学分析等手段发现更丰富的海洋鱼源抗菌肽；2）通过对已发现的海洋鱼源抗菌肽进行组合化学、定量构效关系的整合，以丰富抗菌肽分子库，并借助荧光染色技术、离子通道技术及分子动力学等手段对抗菌肽结构进行合理设计及改造；3）通过运用静电纺丝技术、脂质基纳米递送技术及蛋白纳米粒子技术等纳米材料手段，保证海洋鱼源抗菌肽以饲料添加剂、食品包装材料、营养补充剂等形式在食品工业中发挥实际应用价值。