用HPLC 法同时测定自制复方特比萘酚软膏中3 个主药成分的含量

严 佳，宋洪涛，周 欣 （中国人民解放军联勤保障部队第九〇〇医院药剂科，福建 福州 350025）

浅部真菌病是由致病真菌（皮肤癣菌、念珠菌、马拉色菌等）所致的浅表真菌感染，为皮肤科高发的感染性疾病，以足癣发病率最高，而趾间糜烂型和水疱型为最主要的发病类型。部队官兵作训任务重、居住环境艰苦，且常年穿着透气性较差的胶鞋、作战靴，战士间易交叉感染，是此类型疾病的高发人群。目前，足癣治疗方案为外用抗真菌药物，但临床上使用的多为单方制剂，对治疗合并有细菌感染伴有瘙痒症状的浅部真菌病效果较差，患者有时需使用两种或两种以上的药物，因携带不便，导致依从性较低。因此，本实验在前期研制复方酮康唑软膏的基础上[1]，拟选用盐酸特比萘芬作为外用抗真菌药替代酮康唑，制备一种外用复方制剂——复方特比萘芬软膏，用于治疗浅部真菌皮肤病并发细菌感染，以解决酮康唑化学性质不稳定、易变色的问题，也方便部队官兵携带使用。同时，建立HPLC 法同时测定该复方制剂的3 个主要成分：特比萘酚、糠酸莫米松、莫匹罗星的含量。

1 仪器与试药

1.1 仪器

1 200 型高效液相色谱仪（美国Agilent 公司，DAD 检测器）；DV215CD 型电子天平[奥豪斯仪器（上海）有限公司]。

1.2 试药

盐酸特比萘芬对照品（批号：100563-201402，含量99.8%）、莫匹罗星对照品（批号：130568-200501，含量94.2%）、糠酸莫米松对照品（批号：100930-201201，含量99.9%）均购自中国食品药品检定研究院。盐酸特比萘芬原料药(批号：20150405)、莫匹罗星原料药（批号：20150301）购自武汉鑫佳灵生物科技有限公司；糠酸莫米松原料药（批号：20150228，浙江仙琚制药股份有限公司）。聚乙二醇400、聚乙二醇3350（中国医药对外贸易公司），甲醇为色谱纯，水为超纯水；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备[1]

2.1.1 盐酸特比萘芬对照品溶液的制备

精密称定盐酸特比萘芬对照品10.2 mg，置10 ml量瓶中，用70%甲醇稀释至每1 ml 含盐酸特比萘芬1 020 μg 的对照品储备液。精密移取盐酸特比萘芬对照品储备液1 ml 置10 ml 量瓶中，加70%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得含量为102 μg/ml 的盐酸特比萘芬对照品溶液。

2.1.2 莫匹罗星对照品溶液的制备

精密称定莫匹罗星20.2 mg，置10 ml 量瓶中，用70%甲醇稀释至每1 ml 含莫匹罗星2020 μg 的对照品储备液。再精密移取莫匹罗星的对照品储备液1 ml 置10 ml 量瓶中，加70%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得含量为202 μg/ml 的莫匹罗星对照品溶液。

2.1.3 糠酸莫米松对照品溶液的制备

精密称定糠酸莫米松10.1 mg，置100 ml 量瓶中，用70%甲醇稀释至每1 ml 含糠酸莫米松101 μg的对照品储备液。再精密移取糠酸莫米松的对照品储备液1 ml 置10 ml 量瓶中，加70%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得含量为10.1 μg/ml 的糠酸莫米松对照品溶液。

2.1.4 混合对照品溶液的制备

分别取盐酸特比萘芬、莫匹罗星和糠酸莫米松对照品储备液各1 ml，置10 ml 量瓶中，加70%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.1.5 供试品溶液的制备

精密称取原料药盐酸特比萘芬1 g、莫匹罗星2 g、糠酸莫米松0.1 g，置100 ml 量瓶中，用70%甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品，同法制备3 份。精密吸取上述溶液1 ml 置100 ml 量瓶中，加70%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。

2.1.6 阴性对照溶液的制备

按“2.1.5”项下，分别配制缺盐酸特比萘芬、缺莫匹罗星、缺糠酸莫米松成分的溶液，即得阴性对照溶液。

2.2 色谱条件

色谱柱为ZORBAX SB-C8柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇-0.1%磷酸溶液（70∶30），检测波长248 nm，流速1.0 ml/min，柱温30 ℃，进样量10 μl。

2.3 专属性试验

分别取供试品溶液、对照品溶液及阴性对照溶液适量，滤过，取续滤液10 μl 注入HPLC 仪，分别记录色谱图。实验结果表明，该方法专属性良好，阴性对照无干扰。结果见图1。

2.4 标准曲线制备及线性关系考察

分别精密吸取盐酸特比萘芬、莫匹罗星和糠酸莫米松对照品储备液各0.2、0.4、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、2 ml 置10 ml 量瓶中，用70%甲醇稀释配制成含盐酸特比萘芬浓度为20.4、40.8、81.6、102.0、122.4、142.8、163.2、204.0 μg/ml，含莫匹罗星浓度为40.4、80.8、161.6、202.0、242.4、282.8、323.2、404.0 μg/ml，含 糠 酸 莫 米 松 浓 度 为2.02、4.04、8.08、10.10、12.12、14.14、16.16、20.20 μg/ml的混合对照品溶液，滤过，取续滤液10 μl，按“2.2”项下色谱条件分析，记录色谱图，计算峰面积。以峰面积A对对照品浓度C（μg/ml）线性回归。实验结果表明，盐酸特比萘芬在20.4～204.0 μg/ml 浓度范围内线性关系良好，回归方程为A=1.905×10C+25.90，r=0.999 7；莫匹罗星在40.4～404.0 μg/ml浓度范围内线性关系良好，回归方程为A=2.440C+1.446，r=0.999 8；糠酸莫米松在2.02～20.20 μg/ml浓度范围内线性关系良好，回归方程为A=2.838×10C+15.12，r=0.999 7。

2.5 精密度试验

精密吸取同一份混合对照品溶液6 次，每次10 μl，分别注入HPLC 仪，记录峰面积，计算RSD值。盐酸特比萘酚、莫匹罗星、糠酸莫米松RSD（n=6）分别为0.05%、0.12%、0.25%，实验结果表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验

精密称取同一批供试品6 份，按“2.1.5”项下方法制备供试品溶液，滤过，取续滤液按“2.2”项下色谱条件分析，分别记录色谱图，测定峰面积，计算含量。盐酸特比萘酚、莫匹罗星、糠酸莫米松RSD（n=6）分别为0.19%、0.08%、0.44%，实验结果表明，RSD 均小于1%，方法重复性良好。

图1 复方特比萘芬的HPLC 图

2.7 稳定性试验

取供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12、24 h取样10 μl 注入HPLC 仪，测定并计算不同时间点莫匹罗星、糠酸莫米松和盐酸特比萘芬的含量。盐酸特比萘酚、莫匹罗星、糠酸莫米松RSD（n=6）分别为0.66%、0.77%、0.57%。结果表明，供试品溶液在24 h 内稳定。

2.8 回收率试验

分别精密量取“2.1.1”、“2.1.2”、“2.1.3”项下盐酸特比萘芬、莫匹罗星和糠酸莫米松的对照品储备液各0.8、1、1.2 ml，分别置于3 个10 ml 量瓶中，加70%甲醇稀释至刻度，摇匀，得低、中、高3 种浓度的混合对照品溶液，每个浓度平行配制3 份。滤过，弃去初滤液，取续滤液10 μl 注入HPLC仪，测定并计算。实验结果表明，盐酸特比萘芬、莫匹罗星和糠酸莫米松平均回收率分别为（99.39±0.82）%、（99.21±0.59）%、（99.97±0.81）%，说明此方法回收率符合要求。

2.9 样品含量测定结果

按“2.1.5”项下配制供试品3 批，每批3 份，精密称取供试品1 ml，置于100 ml 量瓶中，加70%甲醇稀释至刻度，摇匀，得供试品溶液9 份，测定，外标法计算药物含量。结果见表1。

表1 样品含量测定结果(n=3， ±s，%)

表1 样品含量测定结果(n=3， ±s，%)

供试品 莫匹罗星 糠酸莫米松 特比萘芬1 99.32±0.26 100.8±0.37 100.2±0.38 2 99.95±0.26 101.2±0.52 101.8±0.56 3 100.3±0.87 101.4±0.72 100.5±1.04

3 讨论

3.1 最大吸收波长的选择

紫外光谱扫描结果显示，盐酸特比萘芬在282 nm具有最大吸收峰，莫匹罗星在220 nm 处具有最大吸收峰，糠酸莫米松在248 nm 处具有最大吸收峰。由于3 个组分中糠酸莫米松含量较低，仅占处方量的0.1%，而盐酸特比萘芬占1%，莫匹罗星占2%。故为了让这3 种药物能同时测定并保证糠酸莫米松的响应值，确定盐酸特比萘芬、莫匹罗星和糠酸莫米松的检测波长为248 nm，在此波长下3 种主药均有较好的响应值，建立的HPLC 法回收率试验结果符合要求。

3.2 色谱条件的选择

笔者曾首先尝试以甲醇-pH5.5 磷酸盐缓冲液（65∶35）作为流动相，色谱柱选用C18柱[2]，结果显示该色谱条件下，盐酸特比萘芬出峰时间太长，而莫匹罗星及糠酸莫米松的出峰时间偏早，且杂峰较多；还曾尝试以甲醇-水、甲醇-醋酸铵、甲醇-乙腈-水、乙腈-水等、甲醇-0.1%磷酸溶液、四氢呋喃-乙腈-四甲基氢氧化铵缓冲液[3-10]作为流动相，试验结果表明，甲醇-0.1%磷酸溶液（70∶30）作为流动相，C8色谱柱的条件下，盐酸特比萘芬出峰时间明显提前，三大主药出峰时间都在20 min 以内，基线平稳，各峰分离度良好；但该条件下盐酸特比萘芬的峰型对称性不佳，有拖尾现象。故在此基础上，考虑莫匹罗星（弱酸性）[11-12]，实验又尝试通过调节流动相pH 改善峰型，发现在pH7.5 时，盐酸特比萘芬具有良好的对称性，但莫匹罗星与糠酸莫米松拖尾严重。为保证大部分主药的峰型良好，本课题最终选用色谱条件为C8色谱柱，甲醇-0.1%磷酸溶液（70∶30）作为流动相。实验采用HPLC 法，建立同时测定盐酸特比萘芬、莫匹罗星和糠酸莫米松的含量测定方法，所建立的分析方法简便、准确、灵敏度高，阴性对照无干扰。