索拉非尼联合伊匹单抗对肝癌抑制作用的实验研究

李延玲，陆蒂青，李金妞，郭杰，卢瑞杰，霍丽亚#

南阳市中心医院1感染科，2儿科，3门诊部，4感染疾病科，河南南阳473000

肝癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，在全球范围内肝癌发病率居第六位，病死率居第四位，严重威胁人民的身心健康。索拉非尼（sorafenib）是首个经美国食品药品管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准用于临床治疗肝癌的靶向分子化疗药物，是一种多激酶抑制性药物，能够通过靶向调控多条信号通路抑制肝癌细胞增殖、新生血管生成及侵袭、转移，且疗效显著，预后效果良好。伊匹单抗是最早被美国FDA批准用于临床治疗肿瘤的免疫检查点抑制剂，可与其他化疗方案联合应用，对肝癌具有显著的治疗效果。本研究探讨索拉非尼联合伊匹单抗对肝癌细胞增殖、侵袭的影响及相关机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂与仪器

HepG2肝癌细胞购自上海细胞库。DMEM培养基、胎牛血清均购自美国Gibco公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白浓度测定试剂盒、兔抗丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MEK）、p-MEK1多克隆抗体均购自碧云天生物技术有限公司；兔抗Raf-1、细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）1、p-ERK1及甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）多克隆抗体均购自美国Abcam公司。Multiskan FC酶标仪购自Thermo Fisher公司；ChemiDocTM XRS凝胶成像系统购自美国伯乐公司。

1.2 CCK- 8法检测细胞活力

将肝癌HepG2细胞接种于96孔板，培养24 h，设置索拉非尼组、伊匹单抗组及联合组，分别加入不同浓度的索拉非尼（5、10、15、20 μmol/L）、伊匹单抗（5、10、15、20 μmol/L）及两药（10 μmol/L索拉非尼+10 μmol/L伊匹单抗），设置空白对照组；每组设3个复孔，培养48 h，加入10 μl的CCK-8溶液，在37℃、5% CO培养箱中培养1 h，取出培养板，于酶标仪波长450 nm处测各复孔吸光度值。

1.3 流式细胞术检测细胞凋亡

以 10 μmol/L 索拉非尼（10 μmol/L 索拉非尼组）、10 μmol/L伊匹单抗（10 μmol/L伊匹单抗组）及两药联合（联合组）分别作用于肝癌细胞，并设立对照组，培养细胞48 h。收集（1～3）×10个细胞，加1 ml磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）1500 r/min离心3 min，洗两遍。用双蒸水将5×Binding Buffer稀释为1×Binding Buffer。取300 μl预冷的1×Binding Buffer重悬细胞。每管各加入3 μl膜联蛋白V（Annexin V）-异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）和 5 μl碘化丙啶（propidium iodide，PI）。轻微混匀后，室温避光孵育10 min。再向每管中加入200 μl预冷的1×Binding Buffer，混匀后上流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.4 Transwell法检测细胞侵袭能力

采用无血清DMEM培养液稀释Matrigel胶，并以每孔400 μl均匀平铺于Transwell上室，去除气泡，并于培养箱中孵育30 min，待其凝固备用。将处于对数生长期的细胞消化、计数，并取2 ml浓度为5×10/ml的细胞于Transwell上室，Transwell下室加入3 ml含10%胎牛血清的细胞培养液，Transwell板于37℃、5% CO培养箱中培养48 h，将上室取出，用棉签将膜表面残留擦去，吸取培养液，并用PBS清洗，甲醇固定20 min，去除甲醇，加入0.1%结晶紫染色20 min，PBS洗涤，显微镜下观察并拍照记录，取4个视野细胞数平均值。

1.5 蛋白质印迹法（Western blot）检测细胞中蛋白表达情况

收集细胞，加入细胞裂解液于4℃摇床上作用细胞30 min，后用移液枪反复吹打细胞约20次，4℃、12 000 r/min离心10 min，收集上清液。测定蛋白浓度并加入上样缓冲液煮沸变性，蛋白样品上样后，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），直至目的蛋白分离，转聚偏氟乙烯膜30 min。5%脱脂奶粉室温下封闭1 h，一抗工作溶液4℃过夜孵育，次日室温孵育二抗，将化学发光试剂加于膜上，于凝胶成像系统中曝光，并分析Raf-1、p-MEK1、p-ERK1目的蛋白条带灰度值。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 索拉非尼对HepG 2肝癌细胞活力的影响

不同浓度索拉非尼处理HepG2细胞，随着浓度增加，细胞吸光度值及增殖率均下降，差异均有统计学意义（

P

﹤0.05）。（表1）

表1 索拉非尼对HepG 2肝癌细胞活力的影响（± s）

2.2 伊匹单抗对HepG 2肝癌细胞活力的影响

不同浓度伊匹单抗处理HepG2细胞，随着浓度增加，细胞吸光度值及增殖率均下降，差异均有统计学意义（

P

﹤0.05）。（表2）

表2 伊匹单抗对HepG 2肝癌细胞活力的影响（± s）

2.3 索拉非尼联合伊匹单抗对HepG 2肝癌细胞活力的影响

10 μmol/L索拉非尼组、10 μmol/L伊匹单抗组以及联合组的细胞增殖率分别为（49.83±0.4）%、（45.53±0.8）%、（33.57±0.9）%，分别低于对照组的100%，差异均有统计学意义（

t

=6.423、8.470、9.651，

P

﹤0.05）。

2.4 索拉非尼联合伊匹单抗对HepG 2肝癌细胞凋亡、侵袭能力的影响

与对照组比较，10 μmol/L索拉非尼组、10 μmol/L伊匹单抗组及联合组细胞侵袭数目均明显减少，凋亡率均明显提高，差异均有统计学意义（

P

﹤0.01）；与10 μmol/L索拉非尼组和10 μmol/L 伊匹单抗组比较，联合组细胞侵袭数目均明显减少，凋亡率均明显提高，差异均有统计学意义（

P

﹤0.01）。（图1、表3）

图1 各组HepG 2肝癌细胞的侵袭能力（结晶紫染色，×200）

表3 各组HepG 2肝癌细胞凋亡率及细胞侵袭数目的比较（± s）

2.5 索拉非尼联合伊匹单抗对HepG 2肝癌细胞中Raf/MEK/ERK信号通路相关蛋白表达情况的影响

与对照组比较，10 μmol/L索拉非尼组、10 μmol/L伊匹单抗组及联合组细胞中Raf-1、p-MEK1、p-ERK1蛋白表达量均明显下调，差异均有统计学意义（

P

﹤0.01）；与10 μmol/L索拉非尼组及10 μmol/L伊匹单抗组比较，联合组细胞中Raf-1、p-MEK1、p-ERK1蛋白表达量均明显下调，差异均有统计学意义（

P

﹤0.01）。（表4）

表4 各组HepG 2肝癌细胞中Raf- 1、p-MEK 1、p-ERK 1蛋白表达量的比较（± s）

3 讨论

索拉非尼是FDA首个批准用于肝癌的靶向分子药物，在肝癌的临床治疗中效果显著，而且联合其他治疗方案治疗效果优于单独给药。在肝癌细胞的抑制作用效果上也发现了索拉非尼与其他药物联合使用的优势，如索拉非尼联合辛二酰苯胺异羟肟酸可显著抑制MHCC97L细胞生长并诱导其凋亡，机制可能与上调内质网应激凋亡通路中CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白（CCAAT-enhancer-binding protein homologous protein，CHOP）的表达有关。索拉非尼与萝卜硫素联合应用对HepG2细胞具有协同抗肿瘤作用，机制可能与诱导细胞凋亡及抑制核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信号通路活化有关。姜黄素联合索拉非尼组抑制肝癌HepG2细胞增殖作用较单药组明显增强，两药联合协同诱导肝癌HepG2细胞产生自噬，其作用机制可能与抑制磷脂酰肌醇-3-羟激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又称AKT）/雷帕霉素靶 蛋白（mechanistic target of rapamycin kinase，MTOR）信号通路有关。伊匹单抗是最早被美国FDA批准用于临床治疗肿瘤的免疫检查点抑制剂，在肝癌的治疗中效果显著。本研究首先采用CCK-8法检测不同浓度索拉非尼（5、10、15、20 μmol/L）、不同浓度伊匹单抗（5、10、15、20 μmol/L）对HepG2肝癌细胞活力的影响，结果表明索拉非尼、伊匹单抗均能显著抑制肝癌细胞增殖，且具有浓度依赖性，而且联合组的抑制效果优于单独给药。另外细胞凋亡率及细胞侵袭数目的检测结果也表明索拉非尼、伊匹单抗单独给药能显著诱导HepG2细胞凋亡，减少细胞侵袭数目，且联合组的抑制效果优于单独给药，说明索拉非尼及伊匹单抗联合应用对肝癌患者的治疗效果可能更佳。

Raf/MEK/ERK是一条经典的丝氨酸苏氨酸蛋白酶途径，能够通过三级激酶模式，将上游信号传递给下游蛋白，最终调控蛋白表达。Raf是Raf/MEK/ERK信号通路的关键因子，Raf激酶的调控涉及与其他信号通路的整合、多位点的磷酸化过程，特别是在细胞增殖、凋亡及分化过程中扮演重要角色。MEK包括MEK1和MEK2，是既具有酪氨酸蛋白激酶活性，又具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性的激酶，当上游Raf激酶被活化后，活化的Raf可与MEK1/2结合，使MEK1/2双重磷酸化，进而激活下游ERK。活化的ERK进入细胞核，诱导转录因子表达，促进细胞增殖。研究已经显示Raf/MEK/ERK信号通路在肝癌的发生发展过程中被高度激活，阻断此信号通路能够显著抑制肝癌细胞的增殖、侵袭、血管生成等生物学行为。目前研究认为索拉非尼通过调控Raf/MEK/ERK信号通路，减少细胞周期蛋白、血管生长因子表达，进而抑制肿瘤细胞增殖，提示索拉非尼对Raf/MEK/ERK信号通路的调控作用。因此本研究继续探讨索拉非尼、伊匹单抗单独或联合给药对肝癌HepG2细胞中Raf/MEK/ERK信号通路相关蛋白表达量的影响，结果表明索拉非尼、伊匹单抗及联合给药均能显著下调Raf-1、p-MEK1、p-ERK1蛋白表达，且联合给药抑制作用优于单独给药。

综上所述，不同浓度的索拉非尼、伊匹单抗对HepG2肝癌细胞的增殖均具有显著抑制作用，且呈浓度依赖性，单独给药、联合给药均能显著抑制肝癌HepG2细胞增殖与侵袭，诱导细胞凋亡，此过程可能与抑制Raf-1/MEK1/ERK1信号通路有关，且联合给药组优于单独给药，提示在临床肝癌治疗中可以考虑二者联合给药，治疗效果可能更佳。