细菌超广谱β-内酰胺酶耐药基因多重实时荧光PCR 检测体系的建立

刘林 付英梅

近年来，随着分子生物学的飞速发展，多重实时荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术得到了广泛应用。多重实时PCR越来越多地应用于病原体诊断及耐药基因检测等方面，如多重实时PCR 结合熔解曲线检测15 种呼吸道病原体[1]；通过直接检测血液中病原体诊断血流感染[2]；多重荧光PCR 在分枝杆菌鉴定方面应用[3]；检测碳青霉烯酶编码基因中应用[4]； 对鲍曼不动杆菌blaVIM、blaIMP和blaNDM基因进行快速检测[5]等。多重实时荧光PCR 不仅在临床检测方面应用广泛，同时还应用于食品安全检测[6]和畜牧业检测等方面[7-8]。其具有高灵敏性，高特异性且操作简便等优点，灵敏度高于经典PCR[9]。本研究以五种常见ESBLs 耐药基因为研究对象，应用多重PCR 方法检测，旨在为革兰氏阴性菌中普遍存在的ESBLs 基因提供了一种快速、准确、灵敏的检测方法。

1 材料和方法

1.1 菌株与试剂

1.1.1 菌株 收集70 株经普通PCR 和DNA 测序明确其超广谱β-内酰胺酶耐药基因类型的菌株。

1.1.2 主要试剂 引物由吉林省库美生物科技有限公司合成、营养琼脂、2×PCR Master Mix、琼脂糖、DNA 上样缓冲液（6×）及50×TAE Buffer、GelRed 核 酸 染 料、100bp ladder，EvaGreen 2×qPCR Master Mix。

1.2 仪器与设备

Thermomixer comfort 舒适型恒温混匀器、Microfuge 22 R 台式微量冷冻离心机、T100™ Thermal Cycler PCR 仪、DYY-6C 电泳仪、Tanon 1600 电泳凝胶成像系统、LightCycler 定量PCR 仪。

1.3 方法

1.3.1 DNA 提取 菌株复苏后取单个菌落加入20 μLddH20混匀，99 ℃金属浴15 min，12000 r/min 离心10 min，取上清液。

1.3.2 反应体系及反应条件 普通多重PCR 及多重实时荧光PCR反应体系：PCR 预混液10 μL，blaTEM/blaSHV/blaOXA-1/blaCTX-M-1-F/R 各0.32 μL，blaCTX-M-9-F/R 0.64 μL，DNA 模板2 μL，ddH2O 补充至20 μL。普通多重PCR 反应条件：94℃ 3 min；94℃ 30 s；55℃ 30 s；72℃ 1 min；30 个循环，延伸72℃，10 min。荧光定量PCR 反应条件：95℃ 300 s；95℃ 10 s；60℃ 20 s；72℃20 s；45 个循环。

单重实时荧光PCR 反应体系各基因上下游引物分别为0.8 μL，其余与多重实时荧光PCR 反应体系及反应条件一致。

1.3.3 多重实时荧光PCR 敏感性及特异性检测 敏感性=真阳性/（真阳性+假阴性）×100%。特异性=真阴性/（真阴性+假阳性）×100%。PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳，与已明确耐药基因菌株比较，计算敏感性及特异性。

1.3.4 多重实时荧光PCR 灵敏度检测 将选定用于灵敏度检测菌株的菌液倍比稀释，活菌计数确定细菌浓度，PCR 检测观察熔解曲线出现目的峰的最低浓度及琼脂糖凝胶电泳条带亮度即将消失所对应浓度，并与多重PCR 琼脂糖凝胶电泳结果比较。

2 结果与分析

2.1 超广谱β-内酰胺酶耐药基因熔解曲线Tm 值

分别以含blaTEM、blaSHV、blaOXA-1、blaCTX-M-1和blaCTX-M-9基因菌株为模板进行实时PCR 反应，blaTEM、blaSHV、blaOXA-1、blaCTX-M-1和 blaCTX-M-9基 因 的 熔 解 曲 线Tm 值 分 别 是77.5 ℃、94.7 ℃、82.8℃、91.6℃、92.6℃（图1）。

图1 超广谱β-内酰胺酶耐药基因熔解曲线Tm 值

2.2 多重实时荧光PCR 敏感性及特异性检测结果

多重实时荧光PCR 中blaSHV、blaCTX-M-1、blaCTX-M-9基因特异性和敏感性均为100%，其中blaTEM、blaOXA-1特异性为100%，敏感性分别为85.1%、91.7%（图2）。

图2 多重实时荧光PCR 敏感性及特异性检测结果

2.3 多重实时荧光PCR 灵敏度检测结果

多重实时荧光PCR 灵敏度测定相应熔解曲线和扩增曲线（图3）显示多重实时荧光PCR 灵敏度可达102cfu/μL。

多重实时荧光PCR 扩增产物琼脂糖凝胶电泳的特异性条带亮度即将消失的对应浓度为102cfu/μL，而该菌株多重PCR 相对应浓度为104cfu/μL，不同基因型灵敏度无明显差异（图4）。

临床菌株耐药表型多样，其中对β- 内酰胺类抗生素耐药最常见，细菌携带超广谱β- 内酰胺酶耐药基因是最常见的耐药原因，ESBLs 耐药基因分子生物学检测，多数研究仅应用单一的PCR 检测技术检测3 ～4 种耐药基因。

多重PCR 一次可检测多个靶标，具有快速、灵敏、高通量性等优点，实时荧光PCR 实验结束后生成一个熔解曲线图和一个峰图。熔解曲线图中可以看到一条随温度升高而荧光信号逐渐降低的下降曲线。峰图中可以看到在标本的Tm 值处出现一个峰，根据峰的高度、宽度、面积及所在位置不同很容易鉴别不同的致病菌。

图3 多重实时荧光PCR 熔解曲线及扩增曲线分析（A：blaCTX-M-1+blaTEM 基因型熔解曲线；B：blaCTX-M-9 基因型熔解曲线；C：blaCTX-M-1+blaTEM 基因型扩增曲线；D：blaCTX-M-9 基因型扩增曲线）

图4 不同菌悬液浓度下多重实时PCR 及普通多重PCR 电泳（1.5%胶电泳；M：100bp ladder；C-：阴性对照10n：菌悬液浓度，单位cfu/μL；A、B 为多重实时PCR 产物电泳；C、D 为相应的普通PCR 产物电泳）

本研究同时应用普通多重PCR 和多重实时PCR 法检测ESBLs 五种常见耐药基因，在相同反应体系下检测两种方法的敏感性、特异性及灵敏度，并结合熔解曲线进行分析。已有文献报道利用熔融曲线分析法检测碳青霉烯酶基因[10]。

本研究中普通多重PCR 反应体系已成功建立，而在多重实时PCR 反应中，对blaSHV、blaCTX-M-1、blaCTX-M-9耐药基因检测敏感性及特异性均可达100%；而对blaTEM、blaOXA-1耐药基因检测未能达到很好的敏感性考虑可能原因有：（1）多重 PCR 在同一个反应体系中存在多对引物，每对引物之间存在着相互竞争和抑制、很可能形成引物二聚体等错综复杂的情况。同时每对引物由于扩增效率的不同，需要反复调整、优化各种引物的浓度及其他反应参数[11]。（2）有报道称利用熔解曲线分辨3 种病毒的特异基因，其核心是PCR 扩增产物的Tm 值之间的差异要≥1.5℃才能有效区分[12]，而本研究中blaTEM、blaOXA-1引物Tm值很接近，熔解曲线Tm 值也较其他三种基因异常。（3）通常荧光PCR 产物长度80-150 bp，最长是300 bp，大片段会对反应造成干扰，而本研究由于与普通PCR 共用引物，PCR 产物长度较大。

灵敏度描述，郑伟峰等[9]报道实时荧光定量PCR 检测灵敏度高于经典PCR 至少100 倍，本研究中多重实时PCR 检测灵敏度高于普通多重PCR 100 倍，并采用cfu/μL 单位。

综上所述，多重实时荧光PCR 在多靶标的检测中发挥很大的作用，具有快速、高灵敏性和准确性优点，实时监测PCR 反应，其熔解曲线及扩增曲线可提供很大的分析价值，但其同样存在不足之处：扩增条件需要探索与协调，多对引物同时扩增，可能出现引物间干扰，且各种试验条件控制不当，引物的设计及靶序列的选择不当都可能降低其灵敏度和特异性，很容易导致扩增失败或非特异性产物出现。