不同寄主、产地和采收期对肉苁蓉有效成分含量的影响

冯 洁，郭晔红*，朱文娟，安 青，陈 彬，焦 鹏

(1. 甘肃省干旱生境作物学重点实验室，甘肃 兰州 730070； 2. 甘肃农业大学 农学院，甘肃 兰州 730070)

肉苁蓉为列当科植物肉苁蓉(CistanchesdeserticolaY. C. Ma)或管花肉苁蓉(Cistanchetubulosa(Schenk) Wight)干燥带鳞叶的肉质茎，亦称大芸[1]，是我国名贵的中药材，也是甘肃省道地药材之一，主要活性成分为苯乙醇苷类和可溶性多糖[2-5]。现代药理学研究表明，肉苁蓉具有助阳通便、抗氧化、抗肿瘤、增强机体免疫力等药理作用[6-13]，主要用于阳痿、不孕、肠燥便秘等[1,4]。

肉苁蓉传统寄主植物为藜科植物梭梭(Haloxylonammodendron(C. A. Mey.) Bunge)和白梭梭(HaloxylonpersicumBunge ex Boiss. et Buhse)，具有耐旱、耐寒、耐盐碱、耐贫瘠等特性[15]，以梭梭为寄主植物种植肉苁蓉已经获得了成功，但梭梭年生长量较小，经济价值较低[15-16]。为了解决传统寄主植物的弊端，甘肃地区技术人员成功种植以四翅滨藜(Atriplexcanescens(Pursh) Nutt. )为寄主植物的肉苁蓉，四翅滨藜和梭梭都属于藜科属植物，两者基源相同，这为接种肉苁蓉提供了科学依据，四翅滨藜生物量大，接种成功可为肉苁蓉提供更多的养分，有益于肉苁蓉的生长，研究表明，四翅滨藜在高盐碱地的造林成活率明显高于红柳、多枝柽柳、梭梭等抗盐碱树种[17]，不同寄主植物生长的肉苁蓉，产地、采收期的不同也会使肉苁蓉的有效成分含量存在差异[18-20]。2015年版《中国药典》只规定了以松果菊苷和毛蕊花糖苷2种苯乙醇苷成分作为指标成分，而中医理论研究表明，中药药效的发挥是多种有效成分共同作用的结果，有效成分含量的多少将直接影响中药药效，因此仅以2种苯乙醇苷成分并不足以全面反映肉苁蓉的整体质量[21-22]。

由于对四翅滨藜寄生肉苁蓉研究较少，而为了探究这种新型寄主植物对肉苁蓉的药效成分的影响，本研究以春、秋2个采收期的四翅滨藜寄生肉苁蓉为研究对象，以梭梭寄生肉苁蓉为对照，基于5种有效成分—松果菊苷、肉苁蓉苷A、管花苷A、毛蕊花糖苷、可溶性多糖对肉苁蓉质量进行较全面考察和分析，进一步揭示了肉苁蓉整体质量特征和道地性品质内涵。同时研究甘肃不同产地梭梭寄生肉苁蓉功效成分的差异性，旨在为肉苁蓉道地产区和采收季节的确定提供科学的理论依据。

1 材料与仪器

1.1 材料

梭梭寄生肉苁蓉分别采收于甘肃省民勤县、景泰县、靖远县肉苁蓉种植基地，四翅滨藜寄生肉苁蓉采收于甘肃省民勤治沙综合试验站。样品经流水洗净，去除泥沙，蒸制软化，切片，再于70℃烘干，粉碎，过4号筛，备用。

1.2 仪器与试剂

试验仪器：Waters Acquity液相色谱仪，PDA检测器，Empower色谱工作站及四元溶剂管理系统(美国Waters公司)；AL104分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；超声波清洗机(深圳市得康科技有限公司)；超纯水器-优普系列(成都优普仪器设备有限公司)；DK-Ⅱ数显恒温水浴锅(天津伊若达仪器设备有限公司)；UV-2450紫外-可见分光光度计(东莞市宏诚光学制品有限公司)。

试验试剂：蒽酮、浓硫酸、乙醇、对照品松果菊苷(批号82854-37-3，质量分数≥98%)、肉苁蓉苷A(批号93236-42-1，质量分数≥95%)、毛蕊花糖苷(批号61276-17-3，质量分数≥98%)均购于成都普菲德生物技术有限公司；管花苷A(批号112516-05-9，质量分数≥98%)购于上海源叶生物科技有限公司；无水葡萄糖购于上海源叶生物科技有限公司；甲酸(德国Merck公司，色谱纯)；甲醇(德国Merck公司，色谱纯)；超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 测定方法

2.1 苯乙醇苷成分的测定

2.1.1 混合对照品溶液的制备

精密称取松果菊苷、肉苁蓉苷A、管花苷A和毛蕊花糖苷对照品适量，置棕色量瓶中，加50%甲醇制成浓度分别为0.57、0.16、0.016、0.048 mg·mL-1混合溶液，摇匀，即得。

2.1.2 供试品溶液的制备

称定样品粉末1.0 g，置100 mL棕色量瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，摇匀，称定，浸泡30 min，超声处理(功率250 W，频率35 kHz)40 min，待冷却至室温，称定，加50%甲醇补足减失质量，摇匀，静置，取上清液，用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.1.3 色谱条件

色谱柱Waters Symmetry C18(50 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为甲醇(A)-0.1%甲酸水溶液(B)，洗脱梯度0～5 min，15%～20%A；5～12 min，20%～45%A；12～16 min，45%～55%A；16～20 min，55%～35%A；20～22 min，35%～15%A；22～24 min，15%A；流速1.0 mL·min-1；检测波长330 nm；进样量10 μL；柱温30 ℃。对照品和供试品的色谱图见图1。

图1 混合对照品(A)和供试品(B)HPLC图Fig.1 HPLC Chromatograms of mixed reference substances(A)and sample(B)注：1.松果菊苷； 2.肉苁蓉苷A； 3.管花苷A ；4.毛蕊花糖苷。

2.1.4 线性关系考察

分别取上述混合对照品溶液0.5、5、10、15、20 μL，按“2.1.3”项色谱条件进行测定。以对照品进样量为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，进行线性回归，得回归方程分别为松果菊苷Y=1×106X+44933，r=0.999 8，线性范围0.285～11.4 μg；肉苁蓉苷AY=1×106X-4454.9，r=0.999 9，线性范围0.08～3.2 μg；管花苷AY=2×106X-9819.9，r=0.999 2，线性范围0.008～0.32 μg；毛蕊花糖苷Y=1×106X-12 989，r=0.999 4，线性范围0.024～0.96 μg。

2.1.5 精密度试验

取“2.1.1”项混合对照品溶液10 μL，连续进样6次，记录4种对照品各自的峰面积，结果松果菊苷、肉苁蓉苷A、管花苷A和毛蕊花糖苷峰面积RSD值分别为0.20%、0.18%、2.10%、1.45%，表明仪器精密度良好。

2.1.6 重复性试验

取同一批肉苁蓉样品6份，按“2.1.2”项制备供试品溶液，“2.1.3”项色谱条件进样，记录峰面积。计算得到松果菊苷、肉苁蓉苷A、管花苷A和毛蕊花糖苷的RSD值分别为0.08%、0.40%、1.11%、0.81%，表明该方法重复性良好。

2.1.7 稳定性试验

取同一批肉苁蓉样品6份，按“2.1.2”项制备供试品溶液，“2.1.3”项色谱条件下于0、2、4、12、24 h进样，记录松果菊苷、肉苁蓉苷A、管花苷A和毛蕊花糖苷峰面积，RSD值分别为0.45%、1.68%、1.89%、1.05%，表明供试品在24 h内稳定。

2.1.8 加样回收率试验

取已知含量的肉苁蓉样品0.5 g，精密称取6份，分别加入适量对照品溶液，加50%甲醇补足至50 mL，按“2.1.3”项色谱条件进样，测得松果菊苷、肉苁蓉苷A、管花苷A、毛蕊花糖苷平均加样回收率分别为103.24%、103.54%、97.67%、101.01%，RSD分别为4.18%、3.89%、3.90%、3.32%，加样回收率良好。

2.1.9 含量测定

按“2.1.2”项下方法制备样品，分别精密吸取供试品溶液各10 μL注入高效液相色谱仪测定。

2.2 可溶性多糖测定

2.2.1 供试品溶液制备

取干燥后的肉苁蓉粉末1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入95%乙醇50 mL，超声30 min，趁热过滤，重复提取1次，滤渣挥干乙醇后加水50 mL，超声处理30 min，重复提取1次。合并滤液，加活性炭吸附脱色，转移至100 mL容量瓶中，蒸馏水定容至刻度线，密塞，摇匀，取1 mL溶液至50 mL量瓶中，蒸馏水定容至刻度线，即得可溶性多糖供试液。

2.2.2 对照品溶液的制备

精密称定葡萄糖对照品12.3 mg，加蒸馏水溶解并定容至100 mL棕色量瓶中。吸取1、3、5、7、8、9 mL分别置于10 mL量瓶中，蒸馏水定容至刻度线，即得到不同浓度的对照品溶液。

2.2.3 含量测定

以蒸馏水做空白对照，取蒸馏水与供试品各2 mL，冰水浴中缓慢加硫酸-蒽酮试液5 mL，摇匀，沸水浴10 min，冷却，于626 nm波长下测定。

2.2.4 方法学考察

精密度试验RSD值为0.65%，表明仪器精密度良好；稳定性试验RSD值为4.55%，表明供试品在2 h内稳定性良好；重复性试验RSD值为0.05%，表明该方法重复性良好。

2.3 数据分析

利用Excel 2010软件进行数据统计，SPSS 23.0 软件进行方差分析。

3 结果及分析

3.1 不同寄主和不同采收季节肉苁蓉苯乙醇苷含量

以甘肃省民勤治沙综合试验站采收的四翅滨藜寄生肉苁蓉和甘肃省民勤县采收的梭梭寄生肉苁蓉为研究对象，通过对不同寄主和不同采收季节肉苁蓉苯乙醇苷含量的测定可以看出(表1)，不同寄主和不同采收季节肉苁蓉苯乙醇苷含量存在差异。秋季采收的不同寄主肉苁蓉中，寄主在四翅滨藜上的肉苁蓉中松果菊苷、肉苁蓉苷A和管花苷A含量均高于寄主在梭梭上肉苁蓉各成分含量，且差异显著(P<0.05)，分别高出了49.05%、49.31%、59.39%。春季采收的不同寄主肉苁蓉中，四翅滨藜寄生肉苁蓉松果菊苷、肉苁蓉苷A和毛蕊花糖苷含量分别高出了梭梭寄生肉苁蓉73.50%、49.29%、50.95%，且差异显著。而以4种苯乙醇苷成分含量作为评价标准，不论是秋季采收还是春季采收，均以四翅滨藜寄生肉苁蓉苯乙醇苷成分含量高。

春季采收的梭梭寄生肉苁蓉中松果菊苷、管花苷A和毛蕊花糖苷含量都高于秋季采收的肉苁蓉，分别高出了29.06%、89.44%、90.77%，且差异显著，而肉苁蓉苷A含量差异不显著。春季采收的四翅滨藜寄生肉苁蓉中松果菊苷、管花苷A和毛蕊花糖苷含量显著高于秋季采收的肉苁蓉，分别高出了63.10%、68.67%、95.03%，而肉苁蓉苷A含量差异不明显。通过对两种不同寄主植物春秋两季采收肉苁蓉中4种苯乙醇苷成分含量进行分析，总体来看，以春季采收的质量较好。

表1 不同寄主和不同采收季节肉苁蓉苯乙醇苷含量

3.2 不同寄主和不同采收季节肉苁蓉可溶性多糖含量

以甘肃省民勤治沙综合试验站采收的四翅滨藜寄生肉苁蓉和甘肃省民勤县采收的梭梭寄生肉苁蓉为研究对象，通过对不同寄主和不同采收季节肉苁蓉可溶性多糖含量的测定可以看出(表2)，秋季采收的不同寄主肉苁蓉中，四翅滨藜寄生肉苁蓉可溶性多糖含量高于梭梭寄生肉苁蓉，高出了24.73%；春季采收的不同寄主肉苁蓉中，梭梭寄生肉苁蓉可溶性多糖含量显著高于四翅滨藜寄生肉苁蓉(P<0.05)，高出了84.97%。不同季节采收的梭梭寄生肉苁蓉中，春季采收的肉苁蓉可溶性多糖含量显著高于秋季采收的肉苁蓉；不同季节采收的四翅滨藜寄生肉苁蓉中，秋季采收的肉苁蓉可溶性多糖含量显著高于春季采收的肉苁蓉(P<0.05)。

表2 不同寄主和不同采收季节肉苁蓉可溶性多糖含量

3.3 不同产地梭梭寄生肉苁蓉苯乙醇苷含量

通过对甘肃省不同产地4种苯乙醇苷含量的测定可以看出(表3)，不同产地的肉苁蓉样品中4种苯乙醇苷类含量存在差异，这可能是由于不同产地药材种植环境差异较大，甘肃民勤肉苁蓉松果菊苷含量为最高，达19.463 mg·g-1，分别高出了甘肃靖远和甘肃景泰74.62%、26.15%，且差异显著(P<0.5)。甘肃景泰肉苁蓉肉苁蓉苷A含量相比其他两个产地较高，达到了5.239 mg·g-1，且显著高于甘肃靖远72.09%。甘肃民勤肉苁蓉管花苷A含量最高为0.260 mg·g-1，高出了甘肃靖远54.74%。甘肃靖远肉苁蓉毛蕊花糖苷含量最高，达到了1.898 mg·g-1。通过对3个产地肉苁蓉4 种苯乙醇苷含量分析，整体来看还是以甘肃民勤的质量最优。

表3 不同产地梭梭寄生肉苁蓉苯乙醇苷含量

3.4 不同产地梭梭寄生肉苁蓉可溶性多糖含量

通过对甘肃省不同产地可溶性多糖含量的测定可以看出(表4)，甘肃景泰肉苁蓉中可溶性多糖含量最高为20.467 mg·g-1，与其他两个产地的肉苁蓉存在显著差距(P<0.05)，3个产地肉苁蓉可溶性多糖含量依次为甘肃景泰>甘肃民勤>甘肃靖远。

表4 不同产地梭梭寄生肉苁蓉可溶性多糖含量

4 讨论与结论

产地、品种及采收期对中药材成分含量的影响一直是学者关注的热点问题，如赵志红等[18]研究发现，肉苁蓉在不同产地种药材的化学成分含量会产生变化；王雪媛等[12]研究发现，肉苁蓉春季、秋季样品中有效成分波动差异较大。本研究结果显示，不同寄主肉苁蓉药材中5种有效成分含量存在较大差异。四翅滨藜寄生肉苁蓉药材中苯乙醇苷和可溶性多糖的含量整体高于梭梭寄生肉苁蓉，原因可能与不同寄主植物、生长条件、水分等多种因素有关[24]。此外，因为四翅滨藜本身生物量大，可能给肉苁蓉提供了大量的养分，而到底是如何传递养分，需要后续的进行进一步说明。现阶段四翅滨藜寄生肉苁蓉研究较少且样本不够多，可为开发四翅滨藜寄生肉苁蓉提供一定的参考价值，为后续肉苁蓉的开发利用提供理论依据。对于春秋两季采收的肉苁蓉，两种不同寄主肉苁蓉药材苯乙醇苷含量均以春季采收的含量最高，梭梭寄生肉苁蓉药材可溶性多糖含量以春季最高，四翅滨藜寄生肉苁蓉可溶性多糖含量以秋季最高。这可能与不同采收期环境中生态因素(如土壤温度、空气温度、空气湿度、光合有效辐射等)会发生不同程度的变化等有关[25-26]，而中国药典规定松果菊苷和毛蕊花糖苷含量作为肉苁蓉质量评价标准，可以得出肉苁蓉以春季采收较好，为后续肉苁蓉采收季节提供理论依据。甘肃不同产地梭梭寄生肉苁蓉苯乙醇苷含量有较大差距，说明产地对肉苁蓉质量有一定的影响，而不同产地肉苁蓉中可溶性多糖含量无较大变化，综合评价出甘肃民勤梭梭寄生肉苁蓉质量最优。

研究结果显示产地和寄主及采收季节均会影响肉苁蓉中苯乙醇含量和可溶性多糖含量。苯乙醇苷类成分，具有较强的补肾阳和神经保护作用，而肉苁蓉含有丰富多糖，具有较强的抗衰老和润肠通便之功效[27-29]。由上述可知，肉苁蓉寄主植物的不同对肉苁蓉质量有一定影响，且各成分含量存在较大差异性。新兴发现的四翅滨藜寄生肉苁蓉质量较好，且春季采收明显好于秋季采收，这需要后续研究学者对四翅滨藜寄生肉苁蓉进行大量研究，制定更加客观统一的质控标准。新兴寄主植物四翅滨藜的成功引入对于提高肉苁蓉资源以及开发利用具有深远意义。