优化CD115稳定性因素以精确检测小鼠单核细胞及其亚群

刘怡宁, 宋濬哲, 蒋晓, 陈超, 周圆, 邢文

中国医学科学院血液病医院(中国医学科学院血液学研究所)，北京协和医学院，实验血液学国家重点实验室，国家血液系统疾病临床医学研究中心，天津 300020

单核细胞(monocyte)在抵御病原微生物入侵和免疫调节等方面发挥重要作用[1]。研究发现，在伤口愈合以及肝脏、肺脏、肾脏等组织器官纤维化过程中，单核细胞及其分化而来的巨噬细胞或纤维细胞发挥关键作用[2-5]；其在骨髓纤维化过程中的作用也屡有报道[6-8]。此外，在血液系统疾病如真性红细胞增多症中，除了红细胞和血小板明显增多外，单核细胞增多也时有发生[9]。因此，利用新方法或新技术对单核细胞进行深入研究，不仅可以进一步揭示其在基础免疫和微生物学中的作用，也可进一步阐明其在某些疾病发生和转归中的作用。

流式细胞术(flow cytometry, FCM)是当代最先进的细胞定量分析技术之一。通过荧光标记的特异性抗体与抗原结合，可快速测定单个细胞的生物学特性，并从群体中分类和收集特定细胞，因此，FCM在细胞生物学、血液学、免疫学等研究中应用广泛[10]。小鼠是研究人类疾病的重要模式动物，但是小鼠与人单核细胞特异性标志并不完全相同。人单核细胞主要根据CD14和CD16的表达情况进行分类；而小鼠单核细胞则主要是CD11b和CD115双阳性细胞[11]。CD115是集落刺激因子1[colony-stimulating factor-1，CSF-1；又称巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor，M-CSF)]受体，主要表达在单核/巨噬细胞和部分树突状细胞及其前体细胞表面。M-CSF作用于CD115，在巨噬细胞的产生、分化和发挥功能等方面具有重要作用[12]。然而，在标本处理过程中，CD115常因各种原因丢失或内化[11,13]，进而影响检测的准确性[14]。

为了提高小鼠单核细胞特异性抗原CD115的稳定性，确保流式检测小鼠单核细胞及其亚群比例的准确，首先对温度、时间和固定因素对CD115的稳定性影响进行了详细研究。由于小鼠外周血比较容易获取，且无需处死小鼠，所以以此进行优化实验。在此优化方法基础上，通过结合流式抗体CD11c、CD49b、Ly6G、Ter119、CD3e和 B220等去除小鼠骨髓及外周血中树突状细胞、NK细胞、粒细胞、不成熟的红细胞、T和B等细胞[15-18]，并使用Ly6C对单核细胞不同亚群进行区分，以期更加精准地分析小鼠单核细胞及其亚群，了解其比例随疾病发生、发展的动态变化。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级别C57BL6小鼠，2月龄，性别不限，均来自中国医学科学院血液病医院(中国医学科学院血液学研究所)实验动物中心。动物实验经本单位伦理委员会审查批准。

1.2 主要试剂

胎牛血清(fetal bovine serum，FBS；以色列Biological Industries公司)；磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS；北京索莱宝科技有限公司)；ACK红细胞裂解液(北京索莱宝科技有限公司)；PBE[含2 μmol·L-1乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraethylene acid，EDTA；赛默飞世尔科技(中国)有限公司)的PBS]；FPBE[含2% FBS(以色列Biological Industries公司)的PBE)]；4,6-二脒基-2-苯基吲哚(4,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI，美国Sigma公司)；流式抗体(均为大鼠来源的抗小鼠抗体，美国eBioscience公司)包括：CD11b-FITC、CD115-APC、Ly6C-PerCP以及APC e-Fluor780标记的Lineage(Lin)抗体：CD11c、CD49b、Ly6G、Ter119、CD3e和B220。

1.3 主要仪器及器材

流式细胞仪 BD FACS Canto Ⅱ(美国Becton Dickinson公司)；小型低温离心机(美国Eppendorf公司)；血细胞计数板(美国Drew Scientific公司)。

1.4 小鼠外周血单细胞悬液的制备

固定小鼠，用毛细吸管取尾静脉血30 μL，置于1 mL PBE中，混匀。1 500 r·min-1，4 ℃离心5 min，弃上清。向细胞沉淀中加入3 mL ACK红细胞裂解液并再次混匀，冰上裂解8 min。再次离心，细胞沉淀用3 mL PBS 洗涤，最后用100目的尼龙膜过滤除去细胞团块。

1.5 温度、放置时间和固定等因素对CD115稳定性的影响

1.5.1温度和放置时间对CD115与抗体结合前稳定性的影响 取小鼠外周血，分12份至EP管中(冰上放置)。取2份立即制备单细胞悬液(方法见1.4)，其中1份作为阴性对照；另1份加入CD11b和CD115抗体，检测其双阳性细胞比例，作为本次实验的初始值。将剩余10份外周血，继续分为冰上和室温2组，分别放置0.25、0.5、1、2和6 h后，制备单细胞悬液；离心，弃上清，先加50 μL FPBE至各管中，混匀；再加入CD11b和CD115抗体各1 μL。混匀后，4 ℃孵育30 min。单阳管中只加1种抗体；阴性对照管则不加任何抗体。上机检测前用PBS洗涤，离心弃上清。最后加入400 μL PBE重悬细胞，并加入1 mg·mL-1的DAPI，用以标记死细胞。上述过程均应控制温度，全程冰上操作。

流式检测时，使用阴性管和单阳管调节各荧光通道的电压和补偿后，先通过前向角和侧向角圈出有核细胞群、去除黏连细胞；接着圈出DAPI阴性的活细胞群和Lin阴性细胞群；检测CD11b和CD115双阳性细胞比例变化。

1.5.2温度和放置时间对CD115与抗体结合后稳定性的影响 取小鼠尾静脉血5份，制备单细胞悬液(冰上放置，方法见1.4)。1份作为阴性对照；其余4份加入CD11b和CD115抗体进行标记。然后取1份，立即检测其双阳性细胞比例，作为本次实验的初始值；剩余3份样本分别在冰上、室温和37 ℃(模拟细胞培养环境)，继续放置0.5、1、2、4和6 h后，检测其双阳性细胞比例变化(方法见1.5.1)。

1.5.3PFA固定对CD115稳定性的影响 在室温和冰上放置2组实验中，每组各取1份小鼠外周血单细胞悬液，加入1%的PFA进行固定放置不同时间后，检测其双阳性细胞比例的变化(方法见1.5.1)。

1.6 优化条件下，小鼠流式抗体标记方法及单核细胞分析

首先制备小鼠骨髓及外周血单细胞悬液。骨髓单细胞悬液制备方法如下：将小鼠脱颈、处死，放在75%酒精中，浸泡5 min。在无菌条件下分离股骨和胫骨，剪去骨两端。用5 mL FPBE冲出骨髓，然后用注射器反复吹吸，将骨髓小粒打散。最后用100目尼龙膜过滤除去细胞团块。外周血单细胞悬液制备方法详见1.4。

取3×106个骨髓细胞，置于1.5 mL EP管中；外周血单细胞则根据实验目的将细胞平均分配至相应数量的EP管中。加入Lin抗体各0.5 μL，CD11b、CD115和Ly6C抗体各1 μL。抗体标记及洗抗等操作方法见1.5.1。

流式检测方法与1.5.1所述方法基本相同，不过需从DAPI阴性的活细胞群中圈出Lin阴性细胞群后，再得到CD11b和CD115双阳性单核细胞群；最后根据Ly6C的表达情况继续将单核细胞分为不同亚群。

1.7 统计分析

流式数据使用FlowjoV10软件进行分析；流式分析结果使用GraphPad Prism 7.0进行统计。

2 结果与分析

2.1 温度和放置时间对CD115与抗体结合前稳定性的影响

获取小鼠外周血这一过程时常在室温条件下进行，标本存放温度和时间也各不相同。Breslin等[14]发现，小鼠外周血在4～8 ℃储存时，CD115稳定性可保持4 h，而在室温条件下，4 h后即明显下降。结果表明，当小鼠外周血样本在冰上放置6 h，其CD11b和CD115双阳性细胞的比例，仅从初始值的1.75%下降到1.63%，仍维持在93%以上；若放置时间延长至8 h，双阳性细胞比例仅维持在初始值的84%(图1)。而在室温条件下，其稳定性仅仅维持0.5 h；在1 h后即大幅下降，仅剩初始值的57%。这说明，在应用流式检测小鼠单核细胞时，必须将样本在低温或冰上储存，上机检测时间不超过6 h；而在室温中超过0.5 h的样本，其检测结果可能偏低。

A：本次实验中，小鼠外周血中CD11b+CD115+所占比例的初始值；B：冰上和室温放置不同时间，CD11b+CD115+比例变化；C：冰上和室温放置时，流式图显示各检测时间点CD11b+CD115+比例

2.2 温度和放置时间对CD115与抗体结合后稳定性的影响

对CD115稳定性的影响因素，目前研究主要集中在前期，即CD115与抗体结合前放置时间和温度的影响。研究显示，CD115抗体能与CD115抗原结合，除了应用于流式检测外[19]，还可作为中和抗体，阻止相关配体结合。CD115与抗体结合后，其稳定性是否受其他因素影响目前未知。在本研究中，将获得的小鼠外周血先与抗体结合(操作在冰上进行，大约2 h)，然后在不同温度下，放置一段时间，观察CD11b和CD115双阳性细胞比例的变化，结果如图2所示。与抗体结合后，继续在冰上放置4 h(加上前期操作的2 h，共计6 h)，CD11b和CD115双阳性细胞的比例并无明显变化，这与前述结果类趋势一致；相反，在室温放置0.5 h，其比例即降至50%以下；而在37 ℃放置0.5 h则下降到10%。这说明，温度升高可降低CD115的稳定性；CD115与抗体结合后，其稳定性并没有变化，在冰上操作时也可稳定6 h。

A：本次实验中，小鼠外周血中CD11b+CD115+所占比例的初始值；B：冰上、室温和37 ℃放置不同时间，CD11b+CD115+比例变化(△：从外周血获取到标抗结束约2 h)；C：冰上、室温和37 ℃条件下，流式图显示各检测时间点CD11b+CD115+比例

2.3 PFA固定对CD115稳定性的影响

研究显示，PFA可保存白细胞抗原，是流式检测中常用的固定液[20-21]。为探究PFA固定对于CD115稳定性的影响，本研究对小鼠外周血样本用抗体标记，再用1% PFA进行固定后，对其CD11b和CD115双阳性细胞的比例进行分析。结果显示，样本在4 ℃放置时，其比例随时间变化不明显，可达3 d，远长于未固定标本的6 h(图3A)；而在室温放置时，其比例在0.5 h即明显下降，仅为初始值的80%左右，其后仍有缓慢下降(图3B)。

A：在冰上放置不同时间，CD11b+CD115+比例变化；B：在室温放置不同时间，CD11b+CD115+比例变化(△：从外周血获取到标抗结束约2 h)

2.4 应用组合抗体检测小鼠骨髓和外周血中的单核细胞及其亚群

为进一步精确分析小鼠单核细胞及其亚群，取骨髓和外周血样本，另外加入Lin抗体和Ly6C抗体，全程冰上操作，6 h内进行流式上机检测；或使用1% PFA固定，72 h内进行检测。结果显示，每个抗体的单阳管都有明显的阳性和阴性细胞，说明其他抗体稳定性良好，这与文献报道一致[11]。继续分析结果(图4)，在骨髓和外周血中，可以看到明显的Lin-CD11b+CD115+的单核细胞群；根据Ly6C信号强弱，可继续将其分为3个亚群。这也进一步说明，优化后的方法可以较为准确地检测小鼠单核细胞及其亚群。

图4 流式分析小鼠骨髓和外周血中单核细胞及其亚群

3 讨论

单核细胞作为机体防御系统的重要组成部分，在抵御病原微生物入侵和免疫调节等方面发挥重要作用。单核细胞数量发生改变与机体炎症或其他疾病状态密切相关。应用流式细胞术检测单核细胞占比变化，有助于揭示单核细胞在疾病发生和转归中的作用。小鼠单核细胞特异性抗原CD115的稳定性较差，在标本处理过程中，常因各种原因丢失或内化，影响检测的准确性。本研究进一步确定了温度、放置时间和固定因素对CD115稳定性的影响，并应用此优化条件，利用抗体组合，更精确地分析小鼠单核细胞及其亚群，为进一步研究单核细胞生物学特性及其在疾病中的作用打下基础。

在应用流式检测小鼠单核细胞时，主要依靠CD11b和CD115 2种细胞表面标志[22]。由于CD115的稳定性较差，温度和放置时间对其影响较大，因此实验操作要求在冰上尽快进行[11, 13]。Breslin等[14]发现，样本在4～8 ℃和EDTA中存放，其CD115可稳定4 h；而在室温4 h后，其下降幅度则达33%。本研究发现，样本在冰上放置时，CD115的稳定时间可达6 h；而在室温放置1 h后，CD115下降幅度即达40%。本研究结果显示，CD115在冰上可放置更长时间，原因可能是冰水温度在0～4 ℃，略低于Breslin等[14]的样本储存温度；本研究中CD115在室温中放置时间则更短，可能与环境温度偏高有关。室温环境的一致性难以严格控制，这是本研究的一个局限因素。该推测也在后续实验中得到验证：当温度达到37 ℃时，大部分CD115在0.5 h左右即消失。另外，体外单核细胞培养时，常在37 ℃孵箱内进行，面对CD115的下降或消失，M-CSF是如何发挥作用将有待于进一步研究。

CD115抗体还可作为中和抗体，阻止相关配体与CD115的结合[19]，本研究发现，在抗体结合前后，CD115的稳定性并没有发生明显变化。至于CD115与抗体结合后是否引起单核细胞信号通路的变化，需要进一步研究。流式检测样本可用PFA进行固定，从而保存白细胞抗原[20-21]。与此一致，本研究也发现，PFA固定可保持CD115抗原抗体的稳定性，尤其在4 ℃条件下，其放置时间可长达3 d。固定后在室温放置时，CD11b和CD115双阳性细胞明显下降，则可能与室温条件下，荧光抗体不稳定有关。

随着流式技术的进展，通过多种抗体组合，对某群特定细胞进行检测或分析成为可能。本研究利用多种抗体组合，进一步对单核细胞及其亚群进行分析，结果比较理想。利用该组合，还可分选到更加均一的单核细胞，进行更为深入地研究。

单核细胞在机体防护、免疫及创伤愈合过程中起协同作用，检查单核细胞计数是辅助诊断的重要方法之一。单核细胞计数的准确性对于疾病诊断的作用可见一斑。应用本研究所得到的优化条件处理样本，全程冰上操作且6 h内上机检测，或使用PFA固定等方法均能有效保证流式检测单核细胞比例的准确性。本研究从小鼠单核细胞特异性抗原CD115的稳定性入手，探究不同因素对于流式检测单核细胞比例准确性的影响，为精准检测小鼠单核细胞提供了技术支持，也为临床研究病人单核细胞生物学特性提供了新思路。