泥鳅抗菌肽提取条件的优化研究＊

张伟韬，彭煜琳，郭建华

（西南大学，重庆 402460）

0 引言

抗菌肽（Antimicrobial peptides，AMPs）是从自然界中提取的一类具有一定抗菌活性的多肽分子，当动物机体受到病原的刺激时，生物自身的天然免疫系统对病原微生物产生的可以发挥免疫效应的多肽类物质[1]，对原虫、细菌、真菌甚至肿瘤细胞在一定程度上都具有抑制效果[2]，是生物体维持自身机体健康的重要物质。现在由于抗生素的广泛使用，导致许多的细菌对抗生素都不敏感，即产生了耐药的现象，因而抗菌肽这种抗生素的替代品逐渐受到重视[3]。

泥鳅具备很好的营养和保健价值，中医上对泥鳅的评价是泥鳅具有养肾生精、补钙壮骨、补血补铁等药用功效，同时还有“水中人参”的佳誉，这与其具有多种活性物质是分不开的[4]，其中重要的一种就是泥鳅抗菌肽。park等[5]从泥鳅中分离得到一种含21 个氨基酸残基的新抗菌肽，命名为泥鳅素，它的抗菌活性非常强，与现有的活性很强的M againin-Ⅱ相比，抗菌活性是它的6 倍[6]。泥鳅素对微生物有很好的广谱抗菌效果。裴颖等[7]用组织匀浆的方法提取泥鳅抗菌肽，研究表明其对嗜水气单胞菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌具有良好的抑菌效果。泥鳅抗菌肽能够杀死众多革兰阳性菌，一些革兰阴性菌及真菌，在这一点上可以和某些广谱抗生素相比。

本实验从泥鳅黏液中提取泥鳅抗菌肽，采用三因素三水平正交试验对泥鳅抗菌肽的提取工艺进行优化，并确定出最佳提取工艺，为以后对泥鳅抗菌肽的提取条件提供参考。

1 试验材料

泥鳅购买于重庆市荣昌区水口寺农贸市场（买回后清水养殖2天～3天），大肠杆菌（Escherichia coli）BL21菌株、冰醋酸、普通营养琼脂培养基、LB 液体培养基由西南大学动物医学院分子实验室提供。

2 试验方法

1）泥鳅抗菌肽的粗提取：挑选无药残、大小8 cm～10 cm的鲜活泥鳅，约20 尾～30 尾，然后清水养殖2 天～3 天，每天换水3 次～4 次，待其吐尽泥沙，将泥鳅放入塑料自封袋中，把带入的水珠用滤纸擦干。轻轻揉压，使其分泌黏液，用注射器吸取自封袋中的粘液，再将体表黏液于4℃，10 000 rpm，离心30 min；设计三因素三水平正交试验见表1，取上清液按正交试验设计来设置9 个处理组合，4℃下浸提完成后按4℃、10 000 rpm的条件，离心30 min，取上清液，调整pH 至7，冷冻干燥后-80℃保存，即为泥鳅黏液生物活性肽的粗提物质。

表1 泥鳅抗菌肽浸提正交试验因素水平

2）粗提物抑菌活性的检测：将冻干后每管内的干粉用200微升的无菌水溶解，以大肠杆菌为受试菌，接种于LB液体培养基中，37℃恒温培养24 h。取100微升培养至对数期的菌液涂在普通琼脂培养基上，在滤纸片上滴10 微升抗菌肽粗提品，37℃培养24 h，重复3次，用氨苄西林溶液（100微克每毫升）作为阳性对照，浸提液作为阴性对照，计算抑菌圈的平均直径，根据抑菌圈大小判定抑菌活性。

3 结果分析

1）抑菌结果。阳性对照（氨苄西林）的抑菌圈直径为26.00 mm，阴性对照（浸提液）无抑菌圈。处理号1、2、3、4、5、6、7、8、9为试验组，具体数据见表2。

表2 泥鳅抗菌肽粗提物对大肠杆菌的正交作用实验结果

2）影响泥鳅抗菌肽提取工艺的因素。利用SPSS数据处理软件对所得数据进行方差分析和直观分析，实验结果表明液料比、浸提时间和乙酸浓度对实验结果的影响显著，但浸提时间和乙酸浓度的R值（见表2）均为0.78，大于液料比（0.61）的R值（见表2）。可见影响泥鳅抗菌肽提取工艺的主要因素为浸提时间和乙酸浓度，料液比为次要因素。

3）不同处理组合的抑菌效果。由SPSS数据处理软件的直观分析可得最优水平处理组为料液比为1∶2、浸提时间为36h、乙酸浓度为5%的组合，不在此次的9 个处理组内，这也说明了正交试验的合理性。

由表3的多重比较可知，处理4、5的抑菌圈直径分别为9.83 mm、10.00 mm，大于其他处理组，处理4、5 和处理2、7、9、6、8、3、1 差异显著，但处理4、5 之间差异不显著，综合考虑到物料成本，实际生产中选择处理4作为优化泥鳅抗菌肽提取工艺的条件。

表3 不同处理抑菌效果多重比较结果

4 讨论

在自2020 年7 月开始实施的禁止抗生素添加到饲料中的政策之后，养殖行业就需要寻找一种新的抗生素替代品，其中一种比较理想的替代品就是抗菌肽。在禁止添加抗生素到饲料的时代，抗菌肽可以成为抗生素的替代物[8]，与抗生素相对比，将抗菌肽作为一种饲料添加剂添加到饲料中，有很多优点，最重要的是没有药物残余、不会对环境有危害[9]，这就没有了生产中的休药期和弃奶期，对人也没有由于药残所带来的危害，另外还有不易对细菌产生耐药的优点，这就不会造成超级细菌的产生，也不会产生毒性作用和其它无关的作用[10]；同时对动物体可以有促生长作用，如饲料中添加微生物源抗菌肽对于吉富罗非鱼的发育过程具有促进作用，同时有利于肠道对饲料的分解吸收[11]；在肉鸡的饲料中添加抗菌肽对于其免疫器官的成熟有促进作用，同时有利于其非特异性免疫屏障功能的提升，从而更好地杀灭病原微生物[12]；在断奶仔猪的饲料中添加抗菌肽可以杀灭许多病原微生物，在很大程度上减少其发生腹泻的情况[13]；在凡纳滨对虾的食物中添加抗菌肽可以增强其抵御外界不良条件的能力，从而减少对虾死亡的数量[14]。基于这些优点，抗菌肽可以成为抗生素的良好的替代品，同时也可以和抗生素合用来起到协同作用增强药物的效果[15]。

泥鳅抗菌肽具有很好的抑菌效果和广谱抑菌范围，是一种比较理想的抗生素替代品，park 等[5]的试验结果说明了泥鳅抗菌肽的广谱性，在较低的含量下可以对真菌酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）对外界环境营养物质的吸收利用产生不利作用，还可以对革兰氏阳性菌如枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌等菌体对外界环境营养物质的利用起到阻碍作用，同时也抑制革兰氏阴性菌如大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌对环境营养物质的吸收，这种效果可以和一些广谱抗生素相比较。但是目前已有的对泥鳅抗菌肽的研究较少，主要是有关抗菌肽的提取过程的研究，未对相关的提取过程进行一定的优化。体外提取的工艺还可以进一步优化，以期提高体外提取过程中粗提取的效率，从而为泥鳅抗菌肽提取进一步的研究做铺垫。现有的提取方法都是将泥鳅直接捣碎，但是这样提取出来的抗菌肽有可能会被蛋白酶水解，而且还要加一定的蛋白酶抑制剂，同时也会混有许多的杂质，较为繁琐。

因而，为了寻找一种更为便捷的提取泥鳅抗菌肽的方法，本实验在前人工作的基础上，用泥鳅为实验材料，从泥鳅粘液中提取抗菌肽粗提品，考虑料液比、浸提时间、乙酸浓度设计一个三因素三水平的正交试验，以泥鳅抗菌肽粗提品的抑菌活性为指标，确定影响提取泥鳅抗菌肽的关键因素和最佳提取组合。结果表明，影响泥鳅抗菌肽提取工艺的主要因素为浸提时间和乙酸浓度，料液比为次要因素，最佳处理组合为料液比1∶2、浸提时间36 h、乙酸浓度为5%的组合。

5 结语

本实验重在研究粗提取的最佳条件，以期得到更高浓度的泥鳅抗菌肽粗提品，为下一步的研究做铺垫,试验结果表明，粗提取出来的泥鳅抗菌肽对大肠杆菌具有一定的抑制作用，而且方法和原料的获取上都较为简便，不需要进一步的过滤，可以考虑在最适合条件下浸提然后冻干加入饲料中，研究其对动物生长性能的影响，以期获得进一步的应用途径。同时得到泥鳅抗菌肽粗提品还可以进一步通过凝胶过滤层析进行纯化，进一步提高其抑菌效果。