中药优化酸奶仙草冻品质及其抗氧化活性研究

林大成，唐婉婷，覃 媚,2，李 瑩,2

1.北部湾大学 食品工程学院，广西 钦州 535011

2.北部湾大学 广西高校北部湾特色海产品资源开发与高值化利用重点实验室，广西 钦州 535011

3.北部湾大学 钦州市特色果蔬发酵重点实验室,广西 钦州 535011

仙草又名仙人草、凉粉草(MesonachinensisBenth，Mesona Blume)，是一种富含仙草多糖(仙草胶)的药食两用植物[1]，也是生产天然、营养、保健食品的理想原料，具有较高的加工利用价值。由于仙草含有丰富的活性物质, 如仙草多糖、花青素及三萜类等成分[2]，因此，以仙草为原料加工的食品被报道具有一定的抗氧化功能[3-5]，其中含仙草提取物的贡丸具有抑制脂质过氧化作用[6]，仙草乳酸菌饮料具有对DPPH自由基清除作用[7]，仙草多糖还具有显著的抗氧化作用[8-9]。仙草制品的应用主要有仙草冻与半固体饮料[1,10-11]，而利用乳酸菌发酵酸奶仙草冻则很少有相关的研究报道,尤其是其抗氧化活性与仙草多糖含量的相关性，以及微生物发酵胞外多糖、中药多糖及仙草多糖的总抗氧化活性，即微生物与植物二者所含活性植物化学物质(phytochemicals)的复合多糖所表现的总抗氧活性[12]等方面的报道更为少见。总多糖具有抗氧化加成效果, 颇具研究意义, 可为食物全营养的总抗氧化活性研究提供理论基础[12]。作者采用中药促进微生物乳酸菌发酵仙草，得到其发酵产物为胞外多糖、中药多糖及仙草多糖的复合多糖，验证其抗氧化保健功效为三者的加成效果，能大幅提高食品的营养价值、改善风味、提升保健作用，为休闲保健食品的应用提供新的方向。

1 材料与方法

1.1 试验材料

黑凉粉仙草: 广西宇峰保健食品有限公司；中药(山药、枸杞、红景天): 湖南金农生物资源股份有限公司；嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(L.delbrueckiisubsp.bulgaricus)、嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)、 优质白砂糖及全脂奶粉等混合乳酸菌种：食品级，市售，1，1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH)、铁氰化钾、亚油酸、硫酸氰氨、菲洛嗪(Ferrozine)、Folin-Ciocalteau试剂及乙二胺四乙酸(Sigma)：西安热默尔生物科技有限公司；乙醇、抗坏血酸、苯酚、三氯乙酸、三氯化铁、氯化亚铁及磷酸盐缓冲液(pH 6.6、pH 7.4)等：分析纯， 广州柏研生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

U-3900型紫外-可见光分光光度计：日本Hitachi日立公司；TG16 MW型台式高速离心机：湖南赫西仪器装备有限公司；KTNK-80型冷冻干燥机：上海乔枫实业有限公司；CelluSep T2管状透析膜(MWCO 18～20 kDa)：上海通善生物科技有限公司。

1.3 单因素试验与正交试验

称取仙草粉10 g,奶粉5 g及经熬煮的中药浓缩液加糖水混合。首先，进行单因素试验，然后，选取糖添加量(12%、14%、16%、18%、20%)、中药添加量(1%、2%、3%、4%、5%)、菌种添加量(8%、10%、12%、14%、16%)和发酵时间(4、6、8、10、12 h)为考察因素，再进行四因素三水平L9(34)的正交优化试验。

1.4 酸奶仙草冻质量感官评价

酸奶仙草冻感官评分方法参考文献[13]，并稍加修改。由3组各10名感官评定员，对不同处理样品进行感官评定。成品质量感官评价指标包括4个方面：组织状态、口感滋味、发酵风味和外观色泽。评价标准见表1。

表1 酸奶仙草冻感官评价标准

1.5 酸奶仙草冻加工工艺

原料(仙草粉、奶粉、糖酸配料)→蒸馏水→搅拌成糊→低温灭菌62 ℃, 35 min→冷却→接种乳酸菌→42 ℃发酵培养→煮沸100 ℃, 2～3 min→静置冷却→成品→感官评定→包装→低温保藏。

1.6 复合多糖的提取

采用醇沉法[14]并略加修改, 以正交试验最佳组合酸奶仙草冻为试验组(EX), 仅添加乳酸菌发酵为控制组(CL), 仅添加中药为对照组(CK)及纯酸奶仙草冻为空白组(BK)分别提取酸奶仙草冻的多糖。将制得新鲜酸奶仙草冻搅碎取汁1.0 mL，稀释10倍加入4倍体积乙醇沉淀，于4 ℃静置 24 h, 然后在4 ℃下5 000g离心15 min。 沉淀物溶于纯水后使用管状透析膜(MWCO 18～20 kDa)透析24 h，透析液在冷冻干燥机中冻干、磨粉后储存在-80 ℃下备用。

1.7 复合多糖溶液的抗氧化功能

以正交试验最佳的组合分别进行抗氧化功能试验。抗氧化功能评估采用DPPH清除能力、还原力、亚铁离子螯合作用及亚油酸过氧化抑制作用等指标, 测定方法参考文献[14]。其中阳性对照组(positive control, PC):亚铁离子螯合作用为EDTA，其余3项为维生素C。

1.8 数据分析

抗氧化功能指标的各项试验都采用Duncan法多重比较，分析统计显著性差异。各试验样品质量浓度为10 mg/mL，每组试验重复3次。

2 结果与分析

2.1 酸奶仙草冻单因素试验(图1)

2.1.1 糖添加量对品质的影响

糖添加量对酸奶仙草冻感官评分的影响如图1a所示，随着糖添加量的增加，酸奶仙草冻的感官评分呈先上升后下降趋势。糖添加量的变化主要影响了乳酸菌的发酵作用，产生酸性滋味，当添加量为16%时，酸奶仙草冻感官评分最高，为(84.3±3.1)分，与其他添加量的评分比较具有显著差异(P<0.05)，此时产品酸甜适中，口感良好，无涩味, 表面光滑，组织状态均匀细腻。当糖添加量大于16%时，促进乳酸菌大量繁殖产生过多乳酸，导致pH值下降反而抑制生长，此时酸甜失调，组织因过酸而崩解，口感不佳。由于糖是提供乳酸菌生长的主要碳源，适量糖可增进乳酸菌正常生长发酵，提高多糖产量, 可增强酸奶仙草冻的抗氧化功能[15]。

2.1.2 中药添加量对品质的影响

中药添加量对酸奶仙草冻感官评分的影响如图1b所示。随着中药添加量的增加，酸奶仙草冻的感官评分呈现下降趋势。初始中药浓度不高，口感尚佳，风味良好，组织状态均匀度一般，凝固效果一般。当中药添加量超过1%时，稍有苦味，风味不佳，口感变差，稍有涩味,凝固效果稍差，有轻微的颗粒感，表面有少量的波纹或坑洞。故最适中药添加量为1%，此时酸奶仙草冻的感官评分最高，为(85.0±2.4)分，除添加量2%与3%外，与其他添加量的评分具有显著差异(P<0.05)。添加适量中药可激发乳酸菌的酶类生化反应、强化发酵，提升多糖产量,复合多糖可增加细胞内抗氧化酶活性，提高酸奶仙草冻的抗氧化功能[15-18]。

2.1.3 菌种添加量对品质的影响

菌种添加量对酸奶仙草冻感官评分的影响如图1c所示，随着菌种添加量的增加，酸奶仙草冻的感官评分呈先上升后下降趋势。菌种添加量达12%时，发酵风味最佳，菌种间良性竞争，生长稳定，色泽均匀一致，有利于胞外多糖的产生；当菌种添加量大于12%时, 菌种过量发生竞争，生长逐渐失衡, 色泽浓郁不均，发酵风味不佳，故最适菌种添加量为12%，此时酸奶仙草冻的感官评分最高，为(84.5±3.6)分，除添加量为10%与14%外，与其他菌种添加量的评分具有显著差异(P<0.05)。适量菌种可使生长稳定并促进乳酸菌发酵增加多糖产量, 也可提升酸奶仙草冻的抗氧化能力[15-16]。

注：曲线上不同字母代表有显著差异(P<0.05)。

2.1.4 发酵时间对品质的影响

发酵时间对酸奶仙草冻感官评分的影响如图1d所示，随着发酵时间的延长，乳酸仙草冻的感官评分呈先逐步上升后下降趋势。初始发酵时间较短时，发酵不充分，风味不足,口感不佳；当发酵时间过长时，释放出乳酸导致酸度过高，稳定稍差并有松垮现象。故最适发酵时间为10 h，此时乳酸仙草冻的感官评分最高，为(92.9±4.2)分，除8 h与12 h外，与其他发酵时间的评分具有显著差异。一般乳酸菌发酵时间以24 h内为黄金时间，配合添加量的提升可缩短约一半的发酵时间，这与王志江等[13]研究得到产品的制备条件为菌种添加量7%、42 ℃下发酵8 h类似，也属合理可行。

2.2 酸奶仙草冻正交优化试验

根据单因素试验结果,选取糖添加量(A)、中药添加量(B)、菌种添加量(C)及发酵时间(D)进行四因素三水平的L9(34)正交优化试验，正交试验及极差分析结果如表2所示。各因素对酸奶仙草冻感官评分影响的主次顺序为B>A>C>D，最优组合为A2B1C2D3，即糖添加量16%、中药添加量1%、菌种添加量12%及发酵时间12 h。较多的糖添加量可促进乳酸菌生长，菌种添加量稍增加可使发酵时间缩短,并可产生一定风味，同时产生较多的胞外多糖，与仙草胶交互作用可强化仙草多糖的胶凝性[19-20]，促进质地组织的弹性口感[21-22],而少量的中药可促进乳酸菌的发酵作用并生成仙草冻的甘味性，但过量则会有苦涩味, 影响口感、色泽。

表2 正交试验结果与分析

2.3 方差分析

由表 3可知，在不考虑交互作用的情况下，发酵时间对酸奶仙草冻品质的感官评分有显著影响，糖添加量、中药添加量及菌种添加量3个因素都表现为极显著影响。F值大小顺序：B>A>C>D，即对产品感官评分的影响因素大小顺序：中药添加量>糖添加量>菌种添加量>发酵时间，与正交试验结果相符。

表3 酸奶仙草冻正交试验的方差分析

2.4 抗氧化保健效果与机理

抗氧化保健效果以DPPH自由基清除能力、还原力、亚铁离子螯合作用及亚油酸过氧化的抑制作用等抗氧化指标作为评估依据,为体现仙草多糖、中药多糖及乳酸菌胞外多糖三者经发酵作用形成复合多糖的抗氧化加成作用, 以多糖含量说明抗氧化活性的叠加效果。

2.4.1 DPPH自由基清除能力

DPPH 自由基清除能力可作为抗氧化剂的强弱指标, 是维持人体内自由基平衡的重要因素之一[14]。 以最佳组合所制酸奶仙草冻对DPPH自由基清除能力如图2所示, 由图2可知，添加中药的试验组(EX)(90.50±3.60)%均比仅添加乳酸菌发酵的控制组(CL)(47.33±1.87)%、仅添加中药的对照组(CK)(43.17±1.81)%及不经乳酸菌发酵纯酸奶仙草冻的空白组(BK)(37.80±2.20)%具有显著较高的DPPH自由基清除能力(P<0.05), 其中，EX的效果是CL的1.8～2.1倍、是CK的1.9～2.3倍、是BK的2.2～2.6倍, 说明最佳试验组含有的中药能提高乳酸菌发酵酸奶仙草冻对DPPH 自由基的清除能力,这可能是仙草所含多糖、多酚、萜类及类黄酮等抗氧化物质, 因中药促进乳酸菌发酵在生化反应中释放而增加[13,17]。仙草多糖能提高抗氧化酶GSH-Px、SOD 及 CAT 的活性，且呈现一定的量效关系[23]。Tang等[8]研究仙草多糖3种活性物质，其中利用酶所提取的抗氧化活性物质，可获得对DPPH自由基清除能力最大的抗氧化活性，其值为(88.91±1.44)%，与本研究相当，显示以中药促进乳酸菌发酵的酶生化反应系统与其具有相同的效果。

2.4.2 还原力

还原力(RP)可作为抗氧化剂能力的评估指标之一，以最佳组合所制酸奶仙草冻的还原力如图2所示。由图2可知，添加中药的试验组(EX)(0.93±0.08,A700)均比仅添加乳酸菌发酵的控制组(CL)(0.49±0.04,A700)、仅添加中药的对照组(CK)(0.42±0.02)及不经乳酸菌发酵纯酸奶仙草冻的空白组(BK)(0.37±0.02,A700)具有显著较高的还原力(P<0.05), 其能力的强弱大致为EX>CL>CK>BK, 其中，EX的效果是CL的1.6～2.2倍、是CK的1.9～2.5倍、是BK的2.2～2.9倍, 说明最佳组合EX含有的中药可提高乳酸菌发酵酸奶仙草冻对还原力的促进作用, 可能是仙草所含多糖、多酚及黄酮等还原物质, 因乳酸菌发酵生化反应而增加[13,17], 此与文献报道还原力的量效呈现正向关系相符[8]。

2.4.3 亚铁离子螯合作用能力

亚铁离子螯合作用能力(FC)也可作为抗氧化剂能力的评估指标之一，是由于过渡金属在脂质氧化过程中具有催化作用。亚铁在过渡金属中具有相当高的反应活性，因此成为最重要的脂类氧化促进剂，对亚铁离子的螯合作用，免于金属螯合活性促进脂质过氧化，是一种抗氧化机制的体现[23]。最佳组合所制酸奶仙草冻对亚铁离子螯合作用的能力如图2所示，可知最佳组合的试验组(EX)(73.40±6.50)%均比仅添加乳酸菌发酵的控制组(CL)(38.48±3.38)%、 仅添加中药的对照组(CK)(33.27±1.65)%及不经乳酸菌发酵纯酸奶仙草冻的空白组(BK)(29.57±0.95)%具有显著较高的亚铁离子的螯合作用能力(P<0.05), 其能力的强弱大致为EX>CL>CK>BK，其中，EX的效果是CL的1.6～2.3倍、是CK的1.9～2.5倍、是BK的2.2～2.8倍，说明最佳试验组含有的中药可促进乳酸菌发酵酸奶仙草冻对亚铁离子的螯合作用能力[17]。Tang等[8]研究仙草粗多糖也显示其具有良好的Fe2+螯合能力，与林丽莎等[5]研究报道一致。

2.4.4 亚油酸过氧化的抑制作用能力

以最佳组合所制酸奶仙草冻的亚油酸过氧化的抑制作用能力(AOA)如图2所示。由图2可知，最佳组合的试验组(EX)(57.80±4.80)%均比仅添加乳酸菌发酵的控制组(CL)(28.13±1.24)%、 仅添加中药的对照组(CK)(26.70±1.11)%及纯酸奶仙草多糖的空白组(BK)(23.67±1.47)% 具有显著较高的亚油酸过氧化的抑制作用能力(P<0.05), 其能力的强弱大致为EX>CL>CK>BK，其中，EX的效果是CL的1.8～2.3倍、是CK的1.9～2.4倍、是BK的2.1～2.8倍，说明最佳试验组含有的中药可提高乳酸菌发酵酸奶仙草冻对亚油酸过氧化的抑制作用能力，可能是仙草所含多糖、黄酮类、酚类化合物等抗氧化物质, 因乳酸菌发酵生化反应而被释放出来[8,12]。仙草多糖增加细胞内抗氧化酶活性，可降低脂质过氧化物生成[5]，Tang等[8]研究指出仙草多糖比维生素 E、二丁基羟基甲苯(bibutyl hydroxy toluene, BHT) 具更强的抗氧化作用, 可抑制脂质过氧化物的形成[5,8,23]。

注:不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

2.5 总多糖与抗氧化活性的关系分析

试验组(EX)总多糖的总抗氧化活性为胞外多糖(CL)、中药多糖(CK)及仙草多糖(BK)之和, 显示中药可能含有某些生物活性因子以激发乳酸菌发酵的酶类生化反应系统，促进多糖产量增加[14,17]，增强抗氧化活性。由图2可知，DPPH自由基清除能力(90.50±3.60)%、还原力(0.93±0.08，A700)、 亚铁离子螯合作用(73.40±6.50)%及亚油酸过氧化的抑制作用(57.80±4.80)%分别有显著的差异效果(P<0.05)。EX的4种抗氧化指标大约为乳酸菌胞外多糖(CL)、中药多糖(CK)及仙草多糖(BK)三者的叠加效果; 且由表4可知，4种抗氧化指标的曲线皆符合菲克定律(Fick’s law)，4个指标的R2值都在0.941 5～0.968 7之间，依菲克定律意义指出各多糖浓度为其总量之和即有加成作用[24], 此与文献[25]研究结果一致，该研究利用中药促进微生物发酵作用的效果, 与前人利用加热或酸水解释出更多的活性物质的效果相当, 可提升抗氧化活性，表现加成作用，以大幅增进保健效果[12,26]，故复合多糖约为乳酸菌的胞外多糖、中药多糖及仙草多糖三者的总和，其抗氧化活性表现亦为三者的叠加总和效果。

表4 试验组复合多糖中4种抗氧化指标的总和效果

3 结论

为开发高质量和保健功能的酸奶仙草冻，利用中药促进乳酸菌发酵仙草胶, 使形成活性乳酸菌发酵胞外多糖、中药多糖及仙草多糖三者结合的复合多糖，以期大幅提升抗氧化保健功能。结果显示最佳工艺条件：糖添加量16%、中药添加量1%、菌种添加量12%及发酵时间12 h。最佳抗氧化保健效果：DPPH自由基清除能力(90.50±3.60)%、还原力(0.93±0.08，A700)、亚铁离子螯合作用(73.40±6.50)%及亚油酸过氧化的抑制作用(57.80±4.80)%等抗氧化指标，皆显著高于控制组、对照组及空白组(P<0.05)，且为三者的叠加效果。故中药可激发乳酸菌生长的酶类生化反应从而促进活性物质的增加，形成高质量的复合多糖，大幅提升酸奶仙草冻的总抗氧化保健效果。