两色金鸡菊提取物对家兔离体十二指肠收缩的影响及其机制

沙爱龙

(重庆三峡学院生物与食品工程学院，重庆市渝东北特色生物资源开发利用工程技术研究中心，重庆三峡学院教师教育学院，重庆 404120)

两色金鸡菊(CoreopsistinctoriaNutt.)，又名高寒香菊、雪菊等，属菊科金鸡菊属植物，在我国主要分布于新疆和田、喀什等地区[1].新疆各中医院和维吾尔族民间已将其作为药材使用，具有清热解毒、抗炎消肿、和胃健脾等功效，有广阔的应用前景[1].已有研究表明，两色金鸡菊提取物具有改善学习记忆、舒张血管、保护心肌、抗氧化、降血压、降血脂等药理作用[2-7]，本课题组前期研究表明两色金鸡菊提取物还具有抗疲劳和耐缺氧[1]、抗衰老[8]和延缓动物的脑及脏器萎缩与退化的作用[9].已有研究报道常熟、恰特草等植物提取物可抑制小肠收缩[10-11]，通过本课题组预试验发现两色金鸡菊提取物也能抑制小肠收缩.目前两色金鸡菊提取物对小肠收缩的影响尚未见报道，本试验通过研究两色金鸡菊提取物对家兔离体十二指肠收缩的影响及机制，以期为新药的研发提供新思路，也为治疗胃肠运动功能紊乱和两色金鸡菊临床新用途提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 试验动物

共56只健康成年家兔(方法“1.5”中用量8只、“1.6”16只、“1.7”32只)，体质量2.0～2.5 kg，雌雄不拘，由新疆医科大学医学实验动物中心提供.

1.2 药品与仪器

两色金鸡菊，采自新疆维吾尔自治区和田地区皮山县克里阳乡喀热曼村，经课题组鉴定.蛋白酶抑制剂、Bay K8644购自Sigma公司，乙酰胆碱转移酶(Acetylcholine transferase，ChAT)测定试剂盒、乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase，A-CHE)测试盒、考马斯亮兰蛋白测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase，TH)ELISA试剂盒购于美国ProSci公司，盐酸维拉帕米购自国药集团化学试剂有限公司，乐氏液(KCl 0.42 g，NaCl 9 g，NaHCO30.2 g，CaCl20.24 g，葡萄糖1.0 g，蒸馏水1 000 mL；所用试剂均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司).

MedLab-U/4C501型生物信号采集处理系统，南京美易科技有限公司；JZ101型张力换能器，北京新航兴业科贸有限公司；HW-400E恒温平滑肌槽，成都泰盟科技有限公司；紫外可见分光光度计，上海棱光技术有限公司；723型可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司；PowerWave XS全波长酶标仪，购于美国Bio-Tek宝特；低速台式离心机，上海安亭科学仪器厂；精密电子天平，上海精科天平；电子天平，上海民桥精密科学仪器有限公司.

1.3 两色金鸡菊提取物的制备

按照课题组先前的研究方法制备两色金鸡菊提取物[1,8]：准确称取磨碎后的两色金鸡菊粉末(过40目筛)10 g，加入10倍质量的蒸馏水，常温浸泡24 h(过夜)，提取3次，过滤，洗涤滤渣，合并滤液于同一瓶中，将滤液浓缩后，以蒸馏水定容至100 mL，即得100 mg/mL高质量浓度两色金鸡菊提取物，后稀释两次，各稀释一倍，得50 mg/mL中质量浓度和25 mg/mL低质量浓度的两色金鸡菊提取物.

1.4 家兔离体十二指肠平滑肌标本的制备

通过耳缘静脉空气栓塞法处死家兔，迅速剖开腹腔，将十二指肠残留内容物撵至空肠，沿边缘分离肠系膜后取1～2 cm长的十二指肠肠段.将肠段置于乐氏液中反复洗净，后用丝线结扎肠段两端，将肠段下端固定于恒温平滑肌槽试验管底端L形钩上，上端用丝线连于张力换能器弹性梁上，通过恒温平滑肌槽内置气泵每秒钟向试验管底端通入1～2个气泡.通过MedLab生物信号采集处理系统采集、记录肠段收缩曲线，稳定10 min后，开始试验，记录指标包括收缩幅度和频率.

1.5 不同质量浓度两色金鸡菊提取物对家兔离体十二指肠收缩幅度和频率的影响

待肠段收缩曲线稳定后，向试验管内加入低质量浓度的两色金鸡菊提取物，记录、观察后用37 ℃乐氏液冲洗3次，待收缩曲线恢复后再依次加入中、高质量浓度两色金鸡菊提取物，分别记录、观察15 min，以加药前的收缩曲线作为对照，记录、分析不同质量浓度两色金鸡菊提取物对家兔离体十二指肠收缩幅度和频率的影响，并计算抑制率.

1.6 两色金鸡菊提取物对Bay K8644诱导的家兔离体十二指肠收缩频率和幅度的影响

待肠段收缩曲线稳定后，向试验管内加入Bay K8644(0.5 μmol/L)，作用5 min后加入高质量浓度两色金鸡菊提取物(100 mg/mL)，此期间观察记录家兔离体十二指肠收缩频率和幅度的变化.另设一组用盐酸维拉帕米(0.1 μmol/L)作为阳性对照.

1.7 两色金鸡菊提取物对家兔离体十二指肠ChAT、A-CHE和TH活性的影响

随机将32只家兔平均分为4组，即乐氏液组和低、中、高质量浓度两色金鸡菊提取物组.制备各组家兔离体十二指肠平滑肌标本，分别取乐氏液和低、中、高质量浓度两色金鸡菊提取物浸浴各组离体十二指肠肠段，15 min后，将肠段剪碎.其中一部分十二指肠组织置于9倍的预冷生理盐水中，冰水浴匀浆10 min制成10%组织匀浆，3 000 r/min离心10 min后取上清液，按照南京建成生物工程研究所提供的试剂盒说明书分别测定各组ChAT、A-CHE活性和蛋白质含量.各组另一部分十二指肠组织置于9倍的磷酸盐缓冲液(PBS)中，加入蛋白酶抑制剂后用冰水浴匀浆10 min制成10%组织匀浆，经反复冻融3次后，5 000 r/min离心5 min后取上清液，按照ELISA试剂盒说明书分别测定各组家兔离体十二指肠TH活性.

1.8 数据统计分析

2 结果与分析

2.1 两色金鸡菊提取物对家兔离体十二指肠收缩幅度的影响

如表1和图1所示，与给药前相比，高、中、低质量浓度组的两色金鸡菊提取物对家兔离体十二指肠收缩幅度都具有抑制作用，其中低、高质量浓度组差异均不显著(P>0.05)，但中质量浓度组差异极显著(P<0.01)，说明50 mg/mL中质量浓度是抑制家兔离体十二指肠收缩幅度的最适质量浓度.

表1 两色金鸡菊提取物对家兔离体十二指肠收缩幅度的影响

图1 两色金鸡菊提取物(CTE)对家兔离体十二指肠收缩的影响Figure 1 Effects of CTE on the contraction of the isolated duodenum in rabbits

2.2 两色金鸡菊提取物对家兔离体十二指肠收缩频率的影响

由表2和图1可知，与给药前相比，两色金鸡菊提取物高、中、低质量浓度组对家兔离体十二指肠收缩频率都具有抑制作用，抑制率随质量浓度升高而逐渐增强，呈现一定的剂量依赖效应.其中高质量浓度组差异显著(P<0.05)，但低、中质量浓度组差异均不显著(P>0.05).

2.3 两色金鸡菊提取物对Bay K8644诱导的家兔离体十二指肠收缩频率和幅度的影响

由表3和图2可知，与给药前相比，单独应用Bay K8644极显著地增加了家兔离体十二指肠收缩频率和幅度(P<0.01).加入高质量浓度两色金鸡菊提取物(100 mg/mL)后，收缩频率和幅度均显著降低(P<0.05)，作用效果与盐酸维拉帕米阳性对照相比要差一些，盐酸维拉帕米与Bay K8644相比差异极显著(P<0.01).

表2 两色金鸡菊提取物对家兔离体十二指肠收缩频率的影响

表3 两色金鸡菊提取物对Bay K8644诱导的家兔离体十二指肠收缩频率和幅度的影响

2.4 两色金鸡菊提取物对家兔离体十二指肠ChAT、A-CHE和TH活性的影响

如表4所示，与正常对照组相比，经不同质量浓度两色金鸡菊提取物处理后家兔ChAT活性均降低，其中中、高质量浓度组差异显著(P<0.05)，但低质量浓度组差异不显著(P>0.05).经不同质量浓度两色金鸡菊提取物处理后家兔离体十二指肠A-CHE和TH活性均高于正常对照组，且均呈现一定的剂量依赖效应趋势，其中,中、高质量浓度组差异都显著(P<0.05)，但低质量浓度组差异都不显著(P>0.05).

表4 两色金鸡菊提取物对家兔离体十二指肠ChAT、A-CHE和TH活性的影响

图2 两色金鸡菊提取物(CTE)对Bay K8644诱导的家兔离体十二指肠收缩的影响Figure 2 Effects of CTE on the contraction of the isolated duodenum in rabbits by Bay k8644

3 讨论

本研究选择十二指肠的原因包括：首先，研究表明，不同小肠段对不同化学药物的作用存在差异.一般来说，十二指肠的作用最强，空肠次之，回肠最弱.其原因主要与小肠不同节段的神经密度分布不同有关，小肠上部多于下部.因此，本研究选取十二指肠，更有利于研究肠肌间神经丛抑制家兔离体十二指肠收缩的机制.而且，十二指肠是小肠的一部分，收缩频率最快，所以很容易记录收缩曲线.其次，十二指肠内容物中的胰液已用预冷任氏液反复冲洗，可以排除消化液的影响.第三，十二指肠的结构和功能与空肠和回肠相似，如果两色金鸡菊提取物能影响十二指肠的运动，也可以影响小肠其他部分的运动.

十二指肠的活动受体液和神经因素的影响.体液因素包括十二指肠平滑肌膜上存在的多种受体，当外源性药物、神经递质与膜上受体结合时，会引起肌细胞信号转导通路改变，从而调节其运动.神经因素包括外来神经(交感和副交感)和肠神经系统的调节，家兔十二指肠离体后虽失去外来神经的支配，但肠神经系统仍存在[12].肠神经系统包括肌间神经丛和黏膜下神经，十二指肠平滑肌运动主要受肌间神经丛调节和支配[13]，构成肌间神经丛的神经元通过释放不同的神经递质调节十二指肠运动，这些神经递质可分为两类，兴奋性神经递质如乙酰胆碱(Acetylcholine，Ach)、促胃液素、5-羟色胺、P物质等可促进十二指肠运动[14]，抑制性神经递质如去甲肾上腺素(Norepinephrine，NE)、促胰液素、肾上腺素、生长抑素等则起抑制作用[15].

Ach是十二指肠运动的兴奋性神经递质，与肌膜上的G蛋白耦联M受体结合后激活腺苷酸环化酶(Adenylate cyclase，AC)，使细胞内的环磷酸腺苷(cAMP)浓度升高，激活蛋白激酶A(PKA)[16]，进而激活L型钙通道(ICa-L)使细胞外Ca2+内流增多[17]，从而导致十二指肠平滑肌收缩增强[18].ChAT能催化体内乙酰辅酶A和胆碱合成Ach[14]，A-CHE则能水解Ach.Bay K8644是ICa-L的激活剂，可促进细胞外大量Ca2+进入细胞内，使十二指肠平滑肌收缩增强，当加入两色金鸡菊提取物后，其收缩效应被明显抑制(P<0.05)，由此推断两色金鸡菊提取物可阻断ICa-L，抑制Bay K8644引起的外钙内流，进而抑制离体十二指肠平滑肌的收缩.NE是十二指肠运动的抑制性神经递质，也是肾上腺素能β受体激动药，可通过激活G蛋白耦联β受体介导的AC- cAMP- PKA信号转导通路，从而松弛十二指肠平滑肌[19].TH是NE合成的限速酶，可作为NE能神经元活性的标志，TH表达升高直接引起NE合成增多[20].由本试验结果可知，两色金鸡菊提取物高、中、低质量浓度组均能使家兔ChAT活性降低、A-CHE和TH活性升高，表明两色金鸡菊提取物可通过调节肠肌间神经丛运动神经元的活动而抑制十二指肠运动：①可通过抑制胆碱能神经递质ACh的合成且促进已释放ACh的分解，从而可能进一步抑制G蛋白耦联M受体介导的AC- cAMP- PKA信号转导通路，最终导致离体十二指肠平滑肌收缩减弱；②可通过抑制肌膜ICa-L从而抑制外钙内流，进而可能抑制Ca2+-钙调蛋白(CaM)信号通路；③可通过升高TH活性引起NE增多，再可能进一步激活G蛋白耦联β受体介导的AC- cAMP- PKA信号转导通路，从而松弛离体十二指肠平滑肌.

4 结论

两色金鸡菊提取物有望在胃肠运动功能亢进等疾病的新药研发中发挥作用，本研究也为拓展两色金鸡菊临床新用途提供了基础理论依据.两色金鸡菊提取物有望应用于小肠平滑肌的舒张，能抑制肠道痉挛、缓解肠胃疼痛、抗损伤肠管的剧烈蠕动，对治疗胃肠动力疾病如腹泻、腹痛、胃肠痉挛等有效.