基于TLR4/NF-κB/Snail1信号通路的槲皮素对糖尿病大鼠肾脏疾病的实验

王兴红 邓海峰 孙缦利 韩 坤 王丹萍

（1.漯河医学高等专科学校,河南 漯河 462000；2.河南省特医食品工程技术研究中心,河南 漯河 462000；3.漯河市第一人民医院内分泌科,河南 漯河 462000）

糖尿病肾脏疾病（DKD）指临床考虑由糖尿病（DM）引起的肾脏病变，是DM引起的严重和危害性最大的一种慢性并发症，也是目前医学界研究的热点之一。DKD的发病机制复杂，最新的研究提出了“炎症发病机制”和抗感染治疗措施。槲皮素是一种天然的黄酮类化合物，因具有广泛的药理作用，愈来愈受到人们的重视，它是具有多靶点作用和综合治疗优势的中药单体[1]。槲皮素对糖尿病大鼠肾脏并发症具有防治作用，但机制尚未明确[2]。课题组前期研究槲皮素可以抑制链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠肾组织中NF-κB的表达发挥对糖尿病DKD大鼠的保护作用[3]，为进一步揭示其作用机制，本研究观察槲皮素对糖尿病大鼠肾组织中TLR4/NF-κB/Snail1信号通路的影响，为槲皮素防治DKD的临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 药物

槲皮素，普利斯公司生产，纯度≥98%，批号180113，其色谱图如图1所示；骁悉，上海罗氏制药有限公司生产，批号180123。

图1 槲皮素色谱图

1.2 动物

成年健康雄性SD大鼠，清洁级，体重300～350 g，由河南省实验动物中心提供（合格证号410117）。全部大鼠常规饲料喂养，自由饮水。

1.3 试剂

链脲佐菌素美国Sigma公司生产，纯度≥98 %（HPLC），批号为20 180911；丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和白细胞介素8（IL-8）ELISA试剂盒购自南京建成生物工程研究所（批号分别为180920、181021、180911和180423）；转化生长因子-α（TGF-α）ELISA试剂盒批号180912、纤维连接蛋白（FN）ELISA试剂盒批号180820、纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI-1）ELISA试剂盒批号181010购自德国Siemens公司；Snail1小鼠抗大鼠单克隆（抗体批号181009）、TLR4小鼠抗大鼠单克隆（抗体批号180907）、NF-κB P65小鼠抗大鼠单克隆抗体（批号181020）、TGF-β1小鼠抗大鼠单克隆（抗体批号171008）、α-SMA小鼠抗大鼠单克隆（抗体批号170911）、collagenШ小鼠抗大鼠单克隆（抗体批号181123）购自美国Santa Cruz公司；α-tubulin（批号180320）购自北京博奥森生物公司。

1.4 仪器

UV-7501紫外分光光度计（无锡科达仪器厂），三诺SXT-1型快速血糖测定仪（长沙），ELX800全自动酶标检测仪（美国），CM1900-1-1恒冷箱冰冻切片机（Leica德国），倒置光显微镜（Leica德国），Power-pac200电泳仪（美国BIO-RAD公司），Trans-Blot电泳湿转仪（美国BIO-RAD公司）。

1.5 方法

1.5.1 动物模型的建立与分组

成年健康雄性SD大鼠适应性喂养1周后，称量体重，一次性腹腔注射STZ 60 mg/kg。注射前动物禁食12 h，不禁水。注射后48 h尾静脉取血，测定血糖，以血糖≥16.65 mmol/L为糖尿病大鼠。正常对照组腹腔注射等体积柠檬酸缓冲液。在实验过程中由于高糖死亡而不能完成血糖测定的大鼠，不列入统计。实验动物随机分为正常对照组、糖尿病模型组、阳性药物组（骁悉11 mg/kg，临用前用生理盐水配成含骁悉10 g/L的溶液，每日灌胃）和槲皮素组（25、50 mg/kg，临用前用生理盐水配成含槲皮素10 g/L的溶液）每日灌胃治疗。正常组和糖尿病模型组按体重换算等体积的生理盐水灌胃。

1.5.2 标本采集与处理

第8周末各组大鼠心脏采血备用并立即处死，剖腹取双侧肾脏标本，用滤纸吸干水分，去包膜，称重，计算肾脏肥大指数（KW/BW，肾脏肥大指数=双侧肾质量/体质量×% ）。右肾-70 ℃冻存备用；左肾固定、石蜡包埋做4μm厚度非连续切片，进行苏木精-伊红染色，光镜下观察肾小球病理形态学变化。

1.5.3 血糖

采用快速血糖仪测定。

1.5.4 血BUN，Scr及24 h尿蛋白测定

用OLYMBUSAU-600全自动生化分析仪测BUN，Scr，采用双缩脲法测定24 h尿蛋白的含量。

1.5.5 血清IL-8、TGF-α、FN、PAI-1检测

ELISA法测定，严格按照试剂盒说明书操作。

1.5.6 肾组织MDA，GSH-Px检测

取右肾，用冰冷生理盐水清理血迹，用滤纸吸干，取组织约150 mg，置于2.0 mL玻璃匀浆器中制备10%的组织匀浆，离心（2500 r/ min离心10 min），取上清放置4 ℃备用。MDA，GSH-Px测定应用紫外分光光度计，严格按照试剂盒说明书操作。

1.5.7 免疫组织化学SP法测定肾组织Snail1的含量

取肾组织切片烤片，常规脱蜡至水、抗原微波热修复、山羊血清液封闭；滴加Snail1一抗(1:100稀释)，4 ℃孵育1 h，滴加抗小鼠生物素化二抗孵育10 min，滴加HRP标记链亲和素孵育10 min，滴加DAB显色，苏木素复染、梯度酒精脱水、二甲苯透明、封片，显微镜观察。Snail1蛋白表达以细胞或结构周围不同程度的棕黄色为阳性。根据免疫组化染色结果，观察各组大鼠肾Snail1的定位和表达。每只大鼠观察6张切片，每张切片于400倍镜下随机选取不重复的5个阳性视野。观察阳性染色部位并采集图像后结合IMAGE J软件分析求得平均光密度值（IOD）。

1.5.8 Western blot测定肾组织TLR4、NF-κBP65、TGF-β1、α-SMA和collagenШ蛋白的含量

取右肾组织，用苯甲基磺酰氟摄取蛋白质，用BCA法测定总蛋白含量。蛋白样品行10%SDS-PAGE电泳，转移至PVDF膜上，封闭，加入一抗TLR4(1：1 000)、NF-κBP65(1：1000)、TGF-β1(1：1000)、α-SMA(1：1 000)和col-Ш(1：1 000)4 ℃过夜，倾去一抗，TBST洗膜3次，每次15 min。洗涤后二抗孵育[羊抗小鼠抗体(1：5 000)]，置于摇床上摇动，室温下1 h，弃去二抗，TBST洗膜3次，每次15 min；ECL发光剂暗室曝光成像、拍照。Western印迹条带经凝胶成像分析系统扫描处理，计算单位光密度值和条带面积，将各实验点的总光密度值与对照组比较，得到相对百分数。

1.6 统计学分析

所有实验数据计量资料用表示，应用SPSS 19.0统计软件进行分析，各组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用LSD-t检验方法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况观察

与正常对照组大鼠做比较，成功建成糖尿病模型组的大鼠出现多饮、多尿、多食的症状，毛发色泽黯淡，精神萎靡，活动减少的表现。随着病程延长，除大鼠体重呈下降趋势外，其他症状更加明显；与糖尿病模型组比较，槲皮素25mg/kg、50mg/kg治疗8周后，上述症状体征得到改善，效果同骁悉组。

2.2 对糖尿病大鼠血BUN，Scr，24h尿蛋白、肾脏肥大指数的影响

如图2所示。与正常对照组比较，糖尿病模型组大鼠血BUN，Scr，24 h尿蛋白、肾脏肥大指数显著升高（P＜0.05或P＜0.01）；与模型组比较，槲皮素25 mg/kg、50 mg/kg组，大鼠血BUN，Scr，24 h尿蛋白、肾脏肥大指数显著降低（P＜0.05或P＜0.01），效果同骁悉组。

图2 各组血BUN，Scr，24h尿蛋白、肾脏肥大指数比较 (,n=6)

2.3 对糖尿病大鼠血清IL-8,TGF-α,FN,PAI-1含量的影响

如图3所示。与正常对照组比较，糖尿病模型组大鼠血清炎症因子IL-8,TGF-α,FN,PAI-1含量显著升高（P＜0.05或P＜0.01）；与模型组比较，槲皮素25 mg/kg、50 mg/kg组，大鼠血清上述炎症因子显著降低（P＜0.05或P＜0.01），效果同骁悉组。

图3 各组血清IL-8,TGF-α,FN,PAI-1含量比较 (,n=6)

2.4 对糖尿病大鼠肾组织Snail1表达的影响

如图4所示。与正常对照组比较，糖尿病模型组大鼠肾组织Snail1表达显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，槲皮素25 mg/kg、50 mg/kg组大鼠肾组织Snail1表达显著降低（P＜0.01），效果同骁悉组。

图4 大鼠肾组织Snail1的表达（免疫组化SP法，×400）

2.5 对糖尿病大鼠肾组织TLR4、NF-κBP65、TGF-β1、α-SMA和col-Ш蛋白表达的影响

如图5、图6所示。与正常对照组比较，糖尿病模型组大鼠肾组织TLR4、NF-κBP65、TGF-β1、α-SMA和col-Ш蛋白表达显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，槲皮素25 mg/kg、50 mg/kg组，大鼠肾组织TLR4、NFκBP65、TGF-β1、α-SMA和collagenШ表达显著降低（P＜0.01）蛋白，效果同骁悉组。

图5 大鼠肾组织NF-κB P65的表达 (Western blot检测)

图6 大鼠肾组织TLR4、TGF-β1、α-SMA和col-Ш蛋白表达(Western blot检测)

3 讨论

DKD是糖尿病最为严重的并发症之一。近年来，免疫炎症学说认为糖尿病是一种天然免疫激活和慢性低度炎症反应为特征的疾病[4]。在炎症的发生发展过程中，TLR4和NF-κB是信号通路的关键因子。TLR4能促进细胞因子的合成与释放，引发炎症反应。TLR4在肾脏中主要存在于肾小管上皮细胞、血管内皮细胞、肾小球系膜细胞。TLR4可以介导多种炎症及急性期反应的细胞因子形成，有研究证实其在DN发生、发展中起重要作用[5]。

DN早期存在明显的巨噬细胞浸润[6]。NF-κB是炎症调控的中心环节[7]。研究表明[8]，单核巨噬细胞可以通过膜表面TLR感受PAMP刺激，经细胞内信号转导，最终由进入胞核内活化的NF-κB启动核内相关基因，合成IL-1、IL-6、IFN-γ、TNF-α等多种促炎因子并释放到细胞外，并形成复杂的细胞因子网络，介导免疫调节和炎症反应。同时NF-κB可促进细胞间黏附分子-1（ICAMP-1）、转化生长因子-β（TGF-β）、纤溶酶原激活物抑制物-1（PAI-1）等炎症介质的释放[9]。肿瘤坏死因子（TNF-α），IL-8 是急性炎症的标志性致炎因子，TNF-α 被认为是炎症发病机制中的前炎症因子，可刺激 IL-8 的释放，两者共同参与了多种因素所致的肾损伤[10-12]；NF-κB激活单核细胞，激活的单核/巨噬细胞可通过释放肿瘤坏死因子（TNF-α）、血小板衍化生长因子等细胞因子及分泌细胞外基质(ECM) 加剧炎症,刺激系膜细胞分泌Ⅳ型胶原、层粘连蛋白、纤维连接蛋白（FN）导致肾小球硬化[13-14]。TLR4可能是NF-κB的上游信号分子，是DN发生的始动信号之一。

有研究表明[15]，Snail1在DM大鼠肾小管高表达，并能通过介导FN生成触发肾小管上皮细胞间质转化，从而参与DKD的发生和发展。因此，有效干预TLR4/NF-κB/Snail1通路成为治疗DKD 的重要手段。糖尿病时肾脏Snail1蛋白表达增多，可损伤肾脏固有细胞,细胞损伤后释放前炎介质,导致白细胞滤出到损伤部位并活化，释放更多的炎症趋化因子（IL-8,TGF-α,FN,PAI-1等）[16-18]。炎症因子已成为DN持续发展过程中的重要危险因素[19]。本实验结果显示：与正常对照组比较，糖尿病大鼠肾组织TLR4、NF-κBP65、TGF-β1、α-SMA和col-Ш蛋白表达增加，血清炎症因子IL-8,TGF-α,FN,PAI-1含量增加。提示糖尿病状态下存在明显的炎症反应过程。

槲皮素是一种天然的黄酮类化合物，存在于多种植物的花、叶、果实中，具有抗氧化、抗炎、抗黏附、抗血栓、抗病毒、抗肿瘤、降血糖、降血脂、降低血压，以及免疫调节作用[20-22]。课题组前期研究槲皮素可以降低肾组织氧化应激水平和增强抗氧化能力，并减少BUN,Scr,24h蛋白尿，发挥保护糖尿病肾脏的作用[23]。本研究进一步探讨了槲皮素对DKD保护作用机制，本研究结果显示槲皮素能通过抑制TLR4/NF-κB/Snail1信号通路来减少血清多种炎症因子IL-8,TGF-α,FN,PAI-1的释放，进而减少肾组织低度炎症反应，发挥抗纤维化作用，从而发挥对肾组织和肾功能的保护作用。其效果同阳性药物骁悉。骁悉的成分是吗替麦考酚酯，霉酚酸酯（简称MMF）是霉酚酸（MPA）的2-乙基酯类衍生物。MPA是高效、选择性、非竞争性、可逆性的次黄嘌呤单核苷酸脱氢酶(IMPDH)抑制剂，可抑制鸟嘌呤核苷酸的经典合成途径。MPA对淋巴细胞具有高度选择作用。吗替麦考酚酯适用于接受同种异体肾脏或肝脏移植的患者中预防器官的排斥反应。综上提示，槲皮素通过其抗炎的作用机制发挥对DKD的保护作用，可能通过调控肾脏TLR4/NF-κB/Snail1信号通路、减轻炎症有关。本研究可能为探明槲皮素的药物治疗的靶点提供可靠靶点，但具体的途径还有待于进一步的研究。