联合检测miR-195、SOCS3 mRNA、miR-210对急性淋巴细胞性白血病的诊断价值分析

徐祖超，刘艳冰

(1.河南科技大学第一附属医院检验科，河南洛阳 471003；2.洛阳市第三人民医院普外科，河南洛阳 471002)

急性淋巴细胞性白血病(acute lymphoblastic leukemia of childhood,ALL)是临床最为常见的儿童肿瘤疾病，主要是由于机体B淋巴细胞发生克隆性异常增殖所致疾病[1]，其病因包括环境因素、遗传性因素以及病毒感染所致的免疫缺陷等。流行病学资料显示，ALL疾病在所有儿童白血病中占比为15%，15岁以下儿童为ALL高发年龄，其中，2～5岁为ALL疾病发病高峰期[2，3]。非编码的微小RNA家族对于肿瘤性疾病的诊断具有积极的作用，其中，miR-195与肿瘤的发生发展以及侵袭转移具有重要意义[4]，SOCS3 mRNA是临床常见的肿瘤标靶性基因，miR-210则与肿瘤细胞的增殖和凋亡密切相关。本研究将通过对联合检测miR-195、SOCS3 mRNA、miR-210在ALL患者诊断及危险度评估中的价值研究，为临床治疗和治疗效果评价提供科学依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2014年2月至2017年2月在我院住院治疗的120例ALL患者为研究对象，其中初诊患者74例、缓解患者22例、复发患者24例。初诊患者中，根据ALL诊断标准[5]，白细胞计数在50×109/L以下，泼尼松反应良好(第8天外周血白血病细胞<1×109/L)；非T-ALL；非成熟B-ALL；无t(9;22)或BCR/ABL融合基因；无t(4;11)或MLL/AF4融合基因；无t(1;19)或E2A/PBX1融合基因则为标危组。无t(9;22)或BCR/ABL融合基因；波尼松反应良好(第8天外周血白血病细胞<1×109/L)；标危诱导缓解治疗第15天骨髓呈M3(原幼淋细胞>25%)或中危诱导缓解治疗第15天骨髓呈M1/M2则为中危组。泼尼松反应不良(第8天外周血白血病细胞>1×109/L)；t(9;22)或BCR/ABL融合基因阳性；t(4;11)或MLL/AF4融合基因阳性；中危诱导缓解治疗第15天骨髓呈M3；第33天骨髓形态学未缓解(>5%)，呈M2/M3则为高危组。标危患者23例、中危患者26例、高危患者25例，标危组男11例，女12例，平均年龄(4.23±1.09)岁；中危组男14例，女12例，平均年龄(3.97±1.00)岁；高危组男14例，女11例，平均年龄(5.11±1.47)岁。另选取本院健康体检儿童120例作为对照组，两组患者的性别、年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)。所有患者的治疗方案均为ALLICB-FM2002治疗方案(泼尼松+柔红霉素+左旋门冬酰胺+环磷酰胺)。所有研究对象家属签署知情同意书，并通过本院医学伦理委员会论证通过，伦理批件的标号为20140511。

纳入标准：①所有患者均符合ALL诊断标准[5]；②均未有肿瘤远处转移；③已获得患者及家属知情同意。排除标准：①严重心脏、肝、肾功能障碍的患者；②对本研究药物过敏患者；③中途停止治疗或者转院患者。

1.2 研究方法

所有患者于入组后清晨空腹抽取外周静脉血5 mL，3 000 r/min离心10 min取上清，将样品立即置于无 DNA 酶和 RNA 酶的灭菌采血真空管内，将所得样品在离心( 3000 r/min，20 min)后，按照Trizol试剂(上海联硕生物科技有限公司)说明书提取血清总RNA，以5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAG GTGCACTGGATACGACTTCAGTT-3′为引物，采用RT-PCR方法进行扩增，使用紫外吸收检测器进行miR-195浓度和纯度测定，使用5′-AGTCAGCCAC-3′为引物，采用上游引物为5′-ACTACAC-3′，下游引物为5′ GTCTGCGGCTCTTCCT-3′进行SOCS3 mRNA扩增，使用紫外吸收检测器进行SOCS3 mRNA浓度和纯度测定；使用反向引物5′-GUCCAG UUUUCCCAGGAAUCCCU-3′进行扩增，使用紫外吸收检测器进行miR-210浓度和纯度测定。见表1。

表1 引物使用情况

1.3 观察指标

1.3.1不同组别研究对象的miR-195、SOCS3 mRNA、miR-210表达水平比较 分别对初诊组、复发组、缓解组以及对照组miR-195、SOCS3 mRNA、miR-210表达水平进行对比分析。

1.3.2初诊组患者不同危险度与miR-195、SOCS3 mRNA、miR-210表达水平的相关性分析 对初诊患者的不同危险度与miR-195、SOCS3 mRNA、miR-210表达水平展开spearman相关性分析。

1.3.3初诊组患者危险度的危险因素多因素分析分别对初诊组患者的危险因素进行logistic多因素分析。

1.3.4单独检测和联合检测对ALL疾病的诊断效能分析 分别使用ROC曲线对单独检测和联合检测对ALL疾病的诊断效能进行对比观察。联合检测采用并联模式，即其中一项指标均为阳性则可进行诊断。

1.4 统计学方法

2 结 果

2.1 研究对象的一般资料比较

不同危险度、对照组、复发组、缓解组以及初诊组性别、年龄等一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 各组研究对象的一般资料比较

2.2 不同组别研究对象的miR-195、SOCS3 mRNA、miR-210表达水平比较

通过对不同组别的miR-195、SOCS3 mRNA、miR-210表达水平进行比较，对照组、缓解组、复发组以及初诊组miR-195、SOCS3 mRNA、miR-210表达水平之间的差异明显(P<0.05)；通过两两比较结果显示，各组miR-195、miR-210表达水平从高到低依次为对照组、缓解组、初诊组、复发组(P<0.05)，SOCS3 mRNA表达水平从高到低依次为复发组、初诊组、缓解组、对照组。通过对初诊组患者的miR-195、SOCS3 mRNA、miR-210表达水平进行分析，不同危险度患者的miR-195、SOCS3 mRNA、miR-210表达水平之间的差异明显(P<0.05)；通过两两比较结果显示，各组miR-195、miR-210表达水平从高到低依次为标危组、中危组和高危组(P<0.05)。SOCS3 mRNA表达水平从高到低依次为高危组、中危组和标危组。见表3，图1。

表3 不同组别研究对象的miR-195、SOCS3 mRNA、miR-210表达水平比较

图1 不同组别研究对象的miR-195、SOCS3 mRNA、miR-210表达水平比较

2.2 初诊组患者不同危险度与miR-195、SOCS3 mRNA、miR-210表达水平的相关性分析

通过对初诊患者的不同危险度与miR-195、SOCS3 mRNA、miR-210表达水平的相关性分析，患者的危险度与miR-195、miR-210表达水平呈现负相关，与SOCS3 mRNA呈现正相关(P<0.05)。见表4。

表4 组患者不同危险度与miR-195、SOCS3 mRNA、miR-210表达水平的相关性分析

2.3 初诊组患者危险度的危险因素多因素分析

通过对初诊患者的危险度多因素logistic回归分析，血清miR-195、miR-210表达水平均可作为ALL疾病的独立保护因素，且SOCS3 mRNA表达水平可作为ALL疾病的危险因素。见表5。

表5 初诊组患者危险度的危险因素多因素分析

2.4 单独检测和联合检测对ALL疾病的诊断效能分析

通过初诊患者的单独检测和联合检测效能对比，标危组、中危组、高危组患者联合检测灵敏度显著高于单独检测，差异存在统计学意义(P<0.05)，且通过对患者的ROC曲线分析，患者的miR-195、miR-210、SOCS3 mRNA的标危、中危以及高危临界值分别为2.43、2、01、1.34；6.32、5.44、4.09；0.66、0.98、1.22。见表6。

表6 单独检测和联合检测对ALL疾病的诊断效能分析

续表6

3 讨 论

ALL疾病是儿童肿瘤性疾病的主要死因之一[6]，同时也是目前临床最为普遍的白血病类型。据研究报道显示，我国的ALL疾病在白血病中占到75%以上[7]。如果早期不进行及时诊断和治疗，患者的预后较差，严重影响患者的生命安全[8]。对于ALL疾病的诊断，传统的诊断主要通过对患者进行骨髓穿刺以检查白细胞情况，但是对于儿童年龄较小患者，由于穿刺技术的掌握以及准确率不尽相同[9]，造成骨髓穿刺并不能在所有儿科检查中进行普及。及时寻找血液指标对于ALL疾病的诊断具有重要价值[10]。随着分子生物学的不断发展，非编码区的微小RNA检查目前成为肿瘤检查的标配，本研究将从分子生物角度，通过联合检测miR-195、SOCS3 mRNA、miR-210在ALL患者诊断及危险度评估中的价值研究，以期为临床ALL疾病的诊断提供科学依据。

在人体的众多核酸类物质中，非编码区的微小RNA虽然不对患者的蛋白质进行编码，但是其在机体细胞的增殖、分化以及凋亡进程中发挥重要作用[11]。有研究报道显示，非编码区的微小RNA在ALL疾病的发生和发展过程中主要发挥原癌基因或抑癌基因的作用[12]。本研究中，miR-195作为抑癌基因在机体发挥作用。有研究报道显示，在机体的其他部位的癌症患者中，其表达水平明显降低，从目前临床报道的miR-195作用的靶基因包括WEEI、CCND3、E2F2等，此类基因靶点与细胞的凋亡相关，此基因主要通过与BCL-2基因上的3′UTR区域相互结合，从而发挥肿瘤细胞的促进凋亡作用。miR-210位于人体11号染色体的P15.5位置，通过与机体的多种靶基因联合作用，对多种组织miR-210表达水平发挥上调和下调作用，从而发挥其抑癌基因作用和促癌基因作用。本研究中，通过对患者和健康人群进行对比，患者的miR-195、miR-210表达水平明显低于健康人群，随着患者的病情危险度的增加，患者的miR-195、miR-210表达水平明显下降。梅妍妍等[13]对miR-210在儿童急性淋巴细胞白血病中的研究发现，miR-210与儿童急性淋巴细胞白血病的严重程度呈现负相关，与本研究结果一致。张素琴等[14]对microRNA-195等在ALL疾病的研究中，随着患者的病情加重，患者的microRNA-195明显下降，与本研究结果一致。SOCS3 mRNA作为JAK/STAT3的信号通路的负性调控，进而在机体中表现为持续抗磷酸化以及抗肿瘤凋亡作用，所以在正常机体中，该基因通常处于沉默状态，随着患者的肿瘤病情进展，患者的SOCS3 mRNA水平明显上升。本研究中，SOCS3 mRNA表达水平从高到低依次为高危组、中危组以及标危组，提示SOCS3 mRNA表达水平可作为临床ALL疾病进展的重要依据。吴正玉等[15]对ALL患者的SOCS3 mRNA表达水平进行分析，SOCS3 mRNA明显上调，对ALL疾病患者的危险度明显上升，与本研究报道相互印证。

另外，有研究结果还显示，联合检测对ALL患者的诊断效能明显上升，对于初诊患者的不同危险度也具有一定的鉴别诊断能力。我们分析认为，作为机体的非编码区微小RNA，虽然不能对人体的重要蛋白进行编码，但是其在机体的抑癌基因和促癌基因的调控具有明显的作用，通过对其水平的上调和下调的综合作用，对于肿瘤细胞的增殖以及凋亡等作用发挥作用。3种指标联合检测对患者的癌症基因的激活状态、肿瘤细胞的凋亡能力以及增殖情况进行综合分析，对于ALL诊断以及效果的评价具有重要意义。但是本研究样本量有限，还存在一定的局限性，有待日后继续进行的大样本研究。

综上所述，联合检测miR-195、SOCS3 mRNA、miR-210在ALL患者诊断中灵敏度较高，且miR-195、SOCS3 mRNA、miR-210表达水平与ALL患者危险度呈显著相关，建议在临床中推广。