复方丹参滴丸减少心肌微血管内皮-间质转化保护缺血-再灌注大鼠的心功能

马有刚，康峰光，徐如林，徐 兰，蔡安平，曾繁芳，黎励文，麦炜颐

（1.中山大学附属第一医院心血管内科//国家卫生健康委员会辅助循环重点实验室（中山大学），广东广州 510080；2.广州中医药大学顺德医院心血管内科，广东佛山 528300；3.广东省人民医院心血管内科，广东广州 510080；4.中国医学科学院阜外医院深圳医院心血管内科，广东深圳 518057）

冠状动脉阻塞引起的持续性缺血可引起心肌梗死（myocardial infarction，MI），进而导致心肌纤维化（cardiac fibrosis，CF）并最终进展为心力衰竭（heart failure，HF）。尽管通过溶栓治疗或直接经皮冠状动脉介入治疗（primary percutaneous coronary intervention，PPCI）及时进行再灌注，但仍有相当多的患者进展为HF 甚至死亡［1］。因此，涉及再灌注预后相关的研究可以进一步使这些人群受益。先前的研究表明心肌组织内血管的内皮间质转化（endothelial-mesenchymal transition，EndMT）可能参与MI及CF的发生、发展［2-4］。当缺血性微环境改变后，心组织内的血管内皮细胞可能会经历EndMT并离开微血管床进入间质，在那里它们分化为成纤维细胞，从而在血管周围区域产生大量的细胞外基质，导致心脏微血管功能障碍，进而减少其血液供应。尽管适度的EndMT有助于MI后肉芽组织的形成参与心脏修复，但过量的纤维疤痕也会导致心室重构和HF。在EndMT 期间，血管内皮细胞会失去其特定的内皮标记物，如血小板内皮细胞粘附分子（platelet endothelial cell adhesion molecule，PECAM/CD31），获得包括平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）在内的间质标记物［5-6］。中医药在心血管疾病防治中具有一定作用，其中复方丹参滴丸（compound Danshen dripping pills，CDDP）于1994 年获得中国食品药品监督管理局批准用于治疗缺血性心绞痛。研究表明，CDDP 可以通过改善心功能、预防心肌缺血和凋亡、减少心肌损伤和纤维化从而产生心血管保护作用［7］。在体内心肌缺血-再灌注（myocardial ischemia reperfusion，MIR）模型中，CDDP 可以减轻心的微循环障碍和心肌损伤、减少MIR 损伤并改善心肌纤维化［8-10］。早期的研究发现CDDP可以保护血管内皮细胞［11-12］。由于EndMT 参与MI 及CF 的发生发展过程，因此，我们推测在冠状动脉阻塞导致的MIR 中，CDDP 可能通过保护心组织内的血管内皮细胞进而抑制过度EndMT的发生而发挥上述心血管保护作用。因此，在这项研究中，我们探讨了MIR 后不同剂量CDDP对心功能的影响，进而研究其对CF的作用，及在心肌微血管EndMT这一病理过程的作用。

1 材料与方法

1.1 主要仪器、试剂及材料

小动物呼吸机（上海继德器械），生理信号采集和处理系统（四川成都仪器），体温维持仪（上海玉研仪器），动物手术器械包（深圳瑞沃德生命科技），小动物气体麻醉机（深圳瑞沃德生命科技），小动物超声成像系统（加拿大FUJIFILM VisualSonics），组织处理系统（美国Thermo Scientific），石蜡包埋系统及切片系统（德国Leica Biosystems），荧光及明场扫描系统（奥地利Taborstrasse），化学发光成像系统（美国ProteinSimple），复方丹参滴丸（天津天士力医药集团有限公司提供），戊巴比妥钠（山东西亚试剂），Western 细胞裂解液及PMSF、SDS-PAGE 试剂盒（上海碧云天生物），ECL 底物（美国Thermo Scientific），HE 染色及Masson 三色染色试剂盒（武汉赛维尔生物），PVDF 膜（德国Merck KGaA），兔抗大鼠α-SMA（英国Abcam），兔抗大鼠CD31（英国Abcam），兔抗大鼠GAPDH（杭州华安生物），山羊抗兔二抗（美国Jackson ImmunoResearch），山羊抗小鼠二抗（美国Thermofisher），免疫荧光抗体α-SMA（美国Affinity），免疫荧光抗体CD31（英国Abcam），Alexa Fluor 488偶联二抗（美国Life Technologies）。

1.2 实验动物及分组

该研究已获得广州永诺生物动物中心实验动物福利与伦理委员会的批准，伦理编号为IACUCG16033。所有实验动物均按照National Research Council 实验动物养护和使用指南（2011 版）进行相应处置。40 只8 周龄雄性SD 大鼠，体质量（250±20）g，购自济南朋悦实验动物育种有限公司。所有实验动物均在温度为（25±2）°C、昼夜周期为12 h、相对湿度为（50±10）%的SPF 动物房饲养。将CDDPs 药丸溶于生理盐水中配制成不同剂量溶液，使用前充分混匀。大鼠在手术前被随机分为以下5 组：假手术组（等量生理盐水灌胃），心肌缺血-再灌注模型组分为对照组（等量生理盐水灌胃）及CDDP 低、中、高剂量组（分别给予40、80、120 mg·kg-1·d-1CDDP灌胃）。所有动物从术后第2天灌胃给药，持续4周。

1.3 心肌缺血-再灌注模型

按照我们既往的方法建立MIR 模型［13］。大鼠在7 d 的适应性饲养和检疫后，腹腔注射戊巴比妥钠（40～50 mg/kg）进行麻醉。夹趾反应确保麻醉后进行气管插管，设置呼吸机参数使其与麻醉大鼠的呼吸频率同步，然后将气管插管连接至呼吸机。手术前，使用生理信号收集和处理系统记录大鼠心电图。经胸骨左缘第3 肋间隙开胸，7-0 丝线结扎左冠状动脉前降支（LAD）。45 min 后，松开结扎线进行再灌注。假手术组仅开胸，并在相应部位穿线但不结扎LAD。手术后，继续对大鼠进行15 min的心电监测，并将其置于30℃的加热垫上直至苏醒。

1.4 超声心动图

5%异氟烷吸入预麻醉大鼠，待动物麻醉后迅速转移到Vevo®3100 小动物超声成像系统的加热垫，并以1-2%的异氟烷维持麻醉。剃除左前胸的皮毛，涂抹少量超声耦合剂，然后使用MX250 超声探头（频率18～25 MHz）测量胸骨旁左心室短轴切面（乳头肌水平）和心室长轴切面的M 模式图像。通过多普勒超声测量二尖瓣E 波及A 波的峰流速（单位cm/s）和其比值（E/A ratio）评估心脏舒张功能。所有图像均以原始格式（DICOM）进行保存，并使用FUJIFILM VisualSonics 的配套软件包VevoLAB 3.0获取超声数据。

1.5 样本采集与制备

10%水合氯醛麻醉大鼠，固定四肢后开胸，获取鼠心，去除心耳及血管组织，并将其横切为两部分。心底1/2 组织使用液氮速冻，随后转移至-80 ℃冰箱进行后续实验。心尖1/2组织固定于40 g/L多聚甲醛，第2天转移至70%乙醇溶液中，然后使用组织处理系统Excelsior™AS 进行梯度乙醇脱水、二甲苯透明及液体石蜡浸蜡，随后通过石蜡包埋系统HistoCore Arcadia 进行包埋留待后续形态学及病理学实验。动物尸体按照中山大学动物伦理及福利规定统一进行无害化处理。

1.6 组织学及形态学分析

将包埋的鼠心组织在石蜡切片系统以5 μm 连续切片，然后按照试剂盒说明进行HE 染色及Masson三色染色。石蜡切片脱蜡至水，HE 染色依次进行苏木素染色3～5 min，自来水冲洗，分化液分化3 s，自来水冲洗，返蓝液返蓝约3 s，自来水冲洗，85%和95%乙醇依次脱水各4 min，伊红染液4～5 min，无水乙醇脱水3次每次4～5 min，正丁醇透明4～5 min，二甲苯透明两次每次2～4 min，中性树胶封片。Masson 染色依次进行Masson A 液15 h，65℃烤箱加热30 min，自来水冲洗，Masson B 液及C 液混合染色1 min，自来水冲洗，1%盐酸酒精分化1 min，自来水冲洗，Masson D 液浸染6 min，快速水洗，Masson E 液浸染约1 min，Masson F 液浸染8 s～15 s，1%冰醋酸漂洗分化3 次每次8 s，无水乙醇脱水3次每次4～5 min，二甲苯透明两次每次2～4 min，中性树胶封片。所有玻片均通过荧光及明场扫描系统TissueFAXS PLUS 以200×进行扫描。Masson三色染色的胶原容积分数（collagen volume fraction，CVF）通过ImageJ（版本1.8.0）插件进行计算［14］。

1.7 免疫荧光检测

石蜡切片脱蜡至水，二甲苯透明3 次，每次5 min，梯度酒精（无水、95%、75%）分别脱水5 min，TBS 冲洗3 次每次3 min。pH9.0 EDTA 高压锅抗原修复2 min，蒸馏水浸洗3 min。3% H2O2阻断30 min，蒸馏水浸洗3 min，组画笔画圈后置于TBST，10%山羊血清室温封闭30 min。弃去血清，每张玻片滴加CD31（1：800）约50 μL，4 ℃孵育过夜。次日，TBST 冲洗3 次玻片，每张玻片滴加50 μL HRP偶联的山羊抗兔二抗（1：4 000），37 ℃孵育45 min，TBST 冲洗3 次每次5min。滴加50 μL CY3 工作液（1：200），室温孵育10 min，TBST 浸洗3 次，每次5 min。pH6.0 柠檬酸抗原修复5 min，蒸馏水浸洗3 min。组画笔画圈后置于TBST，10%山羊血清室温封闭30 min。弃去血清，每张玻片滴加α-SMA（1：200）约50 μL，4 ℃孵育过夜。第3 天，TBST 冲洗3 次玻片，每张玻片滴加50 μL Alexa Fluor488 偶联的驴抗兔二抗（1：400），37 ℃孵育45 min，TBST浸洗3 次每次5 min。每张玻片滴加50 μL DAPI 工作液（1：500），避光染核5 min，TBST 冲洗。荧光封片剂封片，避光保存。所有玻片均通过荧光和明场扫描系统TissueFAXS PLUS 进行扫描，随机采集CD31/α-SMA 阳性染色鼠心组织微血管的400×放大照片。使用ImageJ（版本1.8.0）测量α-SMA 的平均灰度值进行统计分析。

1.8 蛋白质印迹分析

按照试剂说明书，使用细胞裂解液从约150 mg的梗死周边心室组织中提取组织总蛋白。14 000×g离心取上清，混合加样缓冲液，100 ℃煮沸10 min变性蛋白质。将约50 μg 蛋白质在5%～15%的SDS-PAGE中进行电泳，然后转移到0.22 μm PVDF膜上，并在4℃下与CD31（1：1 000）、α-SMA（1：1 000）及GAPDH（1：5 000）孵育过夜。次日，使用TBST 清洗膜并与HRP 偶联二抗（1：10 000）室温孵育1 h，然后在膜上滴加ECL 底物并在化学发光成像系统FluorChem™E中进行曝光。蛋白质条带的积分光密度（Integrated Density，IntDen）使用ImageJ 软件（版本1.8.0）进行测量，计算靶蛋白/内参蛋白的IntDen 比值，然后将其余4 组比值/NS 组比值获得IntDen 比值的倍数。每个靶蛋白均进行3 次重复实验。

1.9 统计分析

所有数据均以Mean±SEM 或Mean±SD 表示（在图注中有详细说明）。数据在Shapiro-Wilk 正态性检验后，各组定量资料都呈正态分布并且作方差齐性检验。方差齐资料用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行分析；反之用多组独立样本Kruskal-WallisH非参数检验进行统计分析，有统计学意义时使用Bonferroni法进行多重比较。P＜0.05的被认为有统计学差异。所有统计分析均使用SPSS 26.0进行。

2 结果

2.1 术中心电图监测结果

为了确保缺血-再灌注模型的稳定性，所有动物均在术中进行心电监测。如图1 所示，心电监测显示结扎左冠状动脉前降支后出现超急性期心肌缺血心电图表现，即T 波逐渐升高；数分钟后出现急性期心肌缺血心电图表现，即ST 段抬高直至弓背向上；结扎30 min 时，心电图出现宽而大的Q 波（即病理性Q 波）。45 min 后，松开结扎线进行再灌注，抬高的ST段逐渐恢复正常。

图1 流程图及代表性术中心电图Fig.1 Flow diagram and representative electrocardiograms

2.2 复方丹参滴丸对缺血-再灌注大鼠心功能的作用

为了研究CDDP 对缺血-再灌注大鼠心功能的作用，在干预终点进行了超声心动图。如图2B 所示，超声结果表明，与假手术组比较，NS 组左室射血分数（ejection fraction，EF）和短轴缩短率（fractional shortening，FS）显著降低（分别为F=13.467、P=0.000；F=13.587、P=0.000），而左室舒张末期容积（left ventricular end-diastolic volume，LVEDV）及E/A 比率显著升高（分别为F=11.333、P=0.001；F=17.590、P=0.000），差异有统计学意义（分别为PEF=0.000、PFS=0.000、PLVEDV=0.001 及PE/A=0.000）。而与NS 组相比，低、中、高剂量CDDP 可改善EF（分别为PL=0.015、PM=0.016、PH=0.008）及FS（分别为PL=0.022、PM=0.022、PH=0.012），减少了LVEDV（分别为PL=0.002、PM=0.011、PH=0.003）并降低了E/A 比率（分别为PL=0.154、PM=0.008、PH=0.005），差异有统计学意义。然而，不同剂量CDDP 组间差异没有统计学意义（P＞0.05）。

图2 不同剂量复方丹参滴丸对缺血再灌注大鼠心功能的作用Fig.2 Effect of different doses of compound Danshen dripping pills on cardiac function in rats with ischemia-reperfusion

2.3 复方丹参滴丸对缺血-再灌注鼠心微环境及纤维化的作用

为了评估CDDP 对缺血-再灌注鼠心组织形态的作用，在干预终点进行了鼠心组织的HE 及Masson染色。HE 染色结果表明，假手术组心肌纤维规律排列，无断裂及坏死性间隙，细胞核梭形或椭圆形。各模型组可见心肌坏死，肌纤维断裂、溶解，肌间隙增大。如图3C所示，Masson 染色结果表明，与假手术组比较，各试验组均出现不同程度纤维化（F=22.753，P=0.000），差异有统计学意义（NS 组P=0.000，低、中、高剂量组分别P=0.003、0.002、0.001）。且不同剂量CDDP 组纤维化程度均较NS组降低，差异有统计学意义（低、中、高剂量组分别P=0.014、0.022、0.036）。然而，不同剂量CDDP 组间差异没有统计学意义（P＞0.05）。

2.4 复方丹参滴丸对缺血-再灌注鼠心微血管内皮-间质转化的作用

为了评估CDDP 对缺血-再灌注鼠心微血管内皮-间质转化的作用，在干预终点进行了鼠心微血管的CD31/α-SMA 免疫荧光染色。如图4A 所示，CY3 标记的CD31（红色荧光）作为血管内皮细胞的标记物，而Alexa Fluor488 标记的α-SMA（绿色荧光）作为血管平滑肌细胞的标记物。图4B 的α-SMA 免疫荧光半定量结果显示，与假手术组比较，各实验组间质标记物α-SMA 的平均荧光强度（mean gray value，MGV）均显著增强（F=88.232，P=0.000），差异有统计学意义（NS 组、中和高剂量组调整的显著性分别PN=0.000、PM=0.000、PH=0.000）。而3 个CDDP 组MGV 均较NS 组显著减弱（调整的显著性分别PL=0.000、PM=0.001、PH=0.041），差异有统计学意义。组间比较结果显示，高剂量组MGV 较低剂量组略增强（P=0.009），而另两个CDDP 组间MGV 差异无统计学意义。

2.5 复方丹参滴丸对缺血-再灌注大鼠心室组织内皮-间质转化的作用

为了评估CDDP 对缺血-再灌注大鼠心室组织内皮-间质转化的作用，进行了梗死周边心室组织总蛋白的Western Blot。如图5所示，数据以倍数表示，与假手术组比较，NS 组的CD31 表达显著降低（0.76±0.02），而不同剂量CDDP 较NS 组显著增加了CD31 的表达（低剂量组：1.06±0.03、中剂量组：1.26±0.04、高剂量组：1.26±0.03）。NS 组的α-SMA表达比假手术组显著升高（1.25±0.01），而不同剂量CDDP 较NS 组显著降低了α-SMA 的表达（低剂量组：0.91±0.01、中剂量组：0.79±0.01、高剂量组：0.83±0.01）。

3 讨论

本研究通过45min 的LAD 结扎随后开放建立MIR 大鼠模型，然后给予不同剂量CDDP 灌胃治疗4 周。结果表明，CDDP 可以改善大鼠再灌注后的心功能，改善再灌注后的鼠心微环境，减少心肌纤维化。

解剖学上，心主要有两种内皮细胞：心内膜内皮细胞（endocardial endothelial cells，EECs）和心脏血管的内皮细胞（vascular endothelial cells，VECs），心脏中的VECs 主要存在于心室肌的致密层［15］，构成小、微血管的内皮。在病理生理上，稳定功能的血管对于维持和恢复缺血心肌的心功能是必不可少的［3］。当冠状动脉阻塞导致心肌缺血后，VECs脱离血管内皮层，然后经EndMT 转化为肌成纤维细胞，导致在血管周围区域的间质中生成大量细胞外基质（extracellular matrix，ECM），从而产生内皮功能显著减弱的间质细胞［16］。最后，微环境被破坏，这又进一步减少了已经缺血心肌的血液供应。因此，保护VECs 并减轻EndMT 的程度可能对缺血再灌注的心脏有益。我们的研究结果表明，不同剂量的CDDP 均可以在一定程度上抑制鼠心微血管EndMT的发生，这表现为在鼠心微血管免疫荧光染色中间质标记物α-SMA 表达的降低，和Western blot 检测到梗死周边心室组织中α-SMA 表达降低以及内皮标记物CD31表达增加。EndMT本质上参与了心肌纤维化的发展过程［17］，因此纤维化程度也可以反映EndMT 的状态。我们的数据表明，不同剂量CDDP 均可减少MIR 后的心肌纤维化，提示CDDP 可能通过减少心组织内血管的EndMT 而减轻了MIR心脏的纤维化。

心肌发生梗死时，收缩性肌纤维丢失，导致收缩功能发生障碍。因心肌梗死引起的间质水肿和心肌纤维化，使左室顺应性受损进而影响其舒张功能。而过度的EndMT 导致大量ECM 在心肌细胞外沉积，破坏了正常的心组织结构，这也加剧了心肌纤维化的程度。我们的研究中，对照组的左室收缩功能障碍表现为EF 及FS 的显著降低和LVEDV 的显著升高，而舒张功能受损表现为E/A 的显著升高。E/A 是体现舒张功能的指标，其在急性心肌缺血及心肌梗死模型中均升高［18］。CDDP 治疗结果表明，其不同剂量在改善鼠心收缩功能的同时对舒张功能也具有一定的作用。因此，通过减少心组织内血管的EndMT 及减轻由此导致的心肌纤维化，可在一定程度上改善缺血及梗死后心功能。

CDDP 是一种由丹参、三七和冰片组成的复方中成药，它在中国已有20 多年的用药历史。2016年，Dantonic®（CDDP 的胶囊制剂）完成了美国食品药品监督管理局的Ⅲ期临床试验（ID：NCT01659580），Top-Line 分析报告显示，Dantonic®可以显著增加慢性稳定型心绞痛患者的总体运动持续时间，并呈现剂量-效应关系。临床上，CDDP的剂量为270mg 每日3 次。在本研究中，我们参考多项研究［9，19］，同时根据Dantonic®Ⅱ期临床试验的每日剂量（低剂量组：250 mg/d，高剂量组：375 mg/d），然后计算人与大鼠之间的体表面积差异得出动物的剂量40、80、120 mg·kg-1·d-13 种剂量。我们的数据表明，CDDP 产生保护作用不完全呈现剂量依赖性。可能原因之一是由于其复杂的成分以及其在体内多功能多靶标的特点。最近的一项研究对CDDP 组分丹参的主要成分丹酚酸A（salvianolic acid，SAA）进行了研究，结果表明SAA具有保护作用并减弱了缺氧诱导的人肺动脉内皮细胞的EndMT［20］。这与我们研究的结果类似，提示CDDP 抑制心组织内血管EndMT作用的主要成分可能是SAA。

当前冠状动脉疾病是最常见的心血管疾病。对于急性MI 患者，至关重要的是尽快开通梗阻的罪犯血管。但是，在血运重建后，MI 的一些并发症（例如“无复流”现象）仍然存在［21］。2018 年ESC/EACTS 指南建议，在血运重建后，应采取药物治疗和其他二级预防措施以及心脏康复策略，以降低心力衰竭来的发病率、死亡率并进一步改善症状。一项早期的中国临床研究用心肌声学造影检查了120 例接受或不接受2 个月CDDP 的PCI 患者的心脏微循环，发现CDDP 可有效改善急性冠脉综合征（acute coronary syndrome，ACS）患者PCI 后心脏的微循环［22］。结合我们的研究，在ACS患者进行再灌注治疗之后给予CDDP 可能进一步减少HF 的发生并改善长期预后。未来仍需要进行大规模的临床研究和更多的体外研究，以探索再灌注后其对缺血心脏保护的最佳方案和可能机制。

综上所述，复方丹参滴丸40、80、120 mg·kg-1·d-1治疗可改善大鼠心肌缺血-再灌注后的心功能，机制之一可能是通过抑制心组织内血管内皮-间质过度转化，进而减少缺血-再灌注后心肌纤维化。