检测山羊嵴病毒的实时荧光定量PCR方法的建立和应用

2021-05-28阿比克哈莫余忠华景志忠

畜牧兽医学报 2021年5期

阿比克哈莫，余忠华，景志忠*，汤承

(1.中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部兽医公共卫生重点实验室，兰州 730046；2.阿坝藏族羌族自治州动物科学技术研究所，红原 624400；3.西南民族大学畜牧兽医学院，成都 610041)

嵴病毒(kobuvirus,KoV)是小RNA病毒科一个新的属。2019年，国际病毒分类委员会(International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)根据KoV的Polyprotein、P1、2C和3CD区氨基酸相似性进一步将其划分为Aichivirus A～F 6个种以及未分类的挪威鼠嵴病毒、灰松鼠嵴病毒和蝙蝠嵴病毒3个种[1]。其中，Aichivirus A成员的人爱知病毒，Aichivirus B成员的牛嵴病毒和Aichivirus C成员的猪嵴病毒为腹泻病原[2-6]。另外Aichivirus A成员的猫嵴病毒和犬嵴病毒也与腹泻相关[7-8]。

目前，在羊中发现了两种不同种的KoVs：绵羊嵴病毒(ovine kobuvirus,OKoV)和山羊嵴病毒(caprine kobuvirus,CKoV)，OKoV是Aichivirus B的成员，而CKoV是Aichivirus C的成员[1]。OKoV首次在匈牙利绵羊的健康粪便样本中检测到[9]，随后在巴西绵羊的健康、腹泻粪便样本和爱尔兰绵羊肠系膜淋巴结中都检测到了OKoV[7,10]。而CKoV最早是在韩国黑山羊的腹泻粪便样本中检测到[11-12]，随后又在意大利山羊的健康和腹泻粪便样本中检测到[13]，2019年，ICTV将CKoV确定为Aichivirus C成员[1]。最近本实验室在四川某地山羊腹泻山羊粪样本中检测到CKoV，证实了该病毒在国内的存在，并获得一个近似完整的基因组[14]。此外，在意大利鹿的粪样中也检测到CKoV[15]，表明其可能具有跨种间传播的能力。到目前为止，国内外CKoV流行病学资料仍然匮乏，并且缺乏合适的分离CKoV的细胞培养体系，因此该病毒对山羊的致病性仍不清楚。

目前，GenBank数据库中有3个CKoV基因组序列，包括本实验室上传的1个中国毒株。病毒基因组由末端结合蛋白(vpg)、5′端非编码区(5′UTR)、1个开放阅读框(ORF)以及3′端非编码区(3′UTR)和聚(A)尾组成。3D基因是KoV最为保守的基因，常作为KoV的分子检测的靶基因[16-20]。目前关于CKoV的分子检测方法有3篇报道[11,13,21]，其中两篇是通过最为保守的3D基因设计的KoV通用引物，通过PCR产物测序来鉴定种，其特异性和检测效率有待于进一步评价。而特异性检测CKoV的分子检测方法只有1篇RT-PCR方法的报道[13]，还未见实时荧光定量PCR检测方法的报道。尽管KoV 3D基因保守，但也存在遗传多样性，并表现出一定的地域特征[22]。目前，GenBank中CKoV 3D基因序列信息不多，只有3个完整的CKoV 3D基因和11个国外毒株的CKoV 3D基因片段。3个完整的CKoV 3D基因核苷酸之间的相似性为92.5%～94.4%，而11个CKoV 3D基因片段核苷酸之间的相似性为68.5%～98.4%，表明CKoV 3D基因存在遗传多样性。本试验的目的是建立基于3D基因特异性检测CKoV的实时荧光定量PCR方法，并调查CKoV在国内的流行情况。

1 材料与方法

1.1 羊常见病原核酸和临床样本

A群羊轮状病毒(ovine rotavirus，ORoV)、羊肠道病毒(caprine enterovirus,CEoV)、羊星状病毒(caprine astrovirus，CAoV)、牛星状病毒(bovine astrovirus,BAoV)、牛冠状病毒(bovine coronavirus,BCoV)、牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)、山羊源产肠毒素大肠杆菌ETEC K99、山羊源沙门菌(Salmonella) CVCC528、奇异变形杆菌(Proteusmirabilis) CVCC3847、山羊源志贺菌(Shigella) CVCC1881菌株、枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)、粪肠球菌(Enterococcusfaecium)的核酸样本，均由西南民族大学动物医学实验室保存并提供。

24份山羊(3月龄以内)腹泻粪样本，于2019年1—12月采自四川成都3个山羊养殖场，用于比较检测方法，由西南民族大学动物医学实验室保存。79份山羊(3月龄以内)腹泻粪样本，于2020年1—4月分别采自西南地区3个省市山羊养殖场，其中四川7个场39份、重庆6个场35份、云南2个场5份，用于流行病学调查。所有样本于-80 ℃保存备用。

1.2 主要试剂及仪器

QuickTaqHS DyeMix购自TOYOBO东洋纺生物科技有限公司；Prime ScriptTMRT试剂盒为大连宝生物工程有限公司产品；pMD19-T载体、DH5α感受态细胞、DNA Marker Ⅰ、Tirzol试剂盒(RNAiso Plus)、TB Green Premix ExTaqⅡ等购自TaKaRa公司；核酸染料GoldenView购自西安赫特生物；Gel Extraction Kit胶回收试剂盒、Plasmid Mini kit质粒小量提取提取试剂盒均为OMEGA公司产品。Doc2000凝胶成像系统为美国Bio-Rad公司产品；荧光定量PCR仪为中国BIOER产品)；Cary50Probe紫外分光光度计为美国Vatian公司产品；TGL-16高速冷冻离心机为中国蜀科公司产品。

1.3 引物设计与合成

查询并下载GenBank收录的CKoV 3D基因序列，共计11个部分3D基因和3个完整的3D基因。利用 MEGA10.0软件分析比对3D基因，采用Primer Premier 5.0软件设计引物(表1)，本研究预期目的片段为176 bp，位于6 874—7 049 nt(GenBank收录号MT584793)。由上海生工生物工程有限公司负责相关引物合成。

表1 4种RT-PCR方法的引物信息Table 1 Primers informations for four kinds of RT-PCR assays

1.4 样品处理及核酸提取

按粪便样品∶灭菌PBS(pH 7.2)体积比1∶5制备粪悬液。粪悬液于-80 ℃反复冻融3次，8 000 r·min-14 ℃离心10 min，取上清，经0.22 μm一次性滤器过滤后再取上清300 μL，用TrizolTMReagent试剂盒提取样本总RNA[23]。提取的RNA用Prime ScriptTMRT试剂盒反转录成cDNA，酚-氯仿法提取DNA[23]，-20 ℃保存备用。

1.5 阳性标准品的制备

以CKoV SWUN/F11/2019毒株的cDNA为模板，用自行设计的特异性引物CKoV F/R(表1)进行RT-PCR扩增。采用25 μL反应体系：CKoV F和CKoV R各1.0 μL，模板1.5 μL，EmeraldAmp PCR Master Mix 12.5 μL，ddH2O补足至25 μL。反应条件同文献[23]“阳性标准品的制备”。反应结束后，3.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定产物。鉴定正确后，胶回收扩增产物并连接至pMD19-T，后续操作同文献[23]。最后提取重组质粒，送生工生物有限公司测序，以测序结果正确的重组质粒作为阳性标准品。用紫外分光光度计检测上述阳性标准品的浓度，并按照以下公式换算为拷贝数，拷贝数(copies·μL-1)=(6.02×1023copies·mol-1)×(浓度 μg·mL-1)×10-9/(分子质量 g·mol-1)。

1.6 反应体系及条件的优化

1.6.1 退火温度的优化采用20 μL体系：CKoV阳性标准品1.5 μL，TB Green Premix ExTaqII 10 μL,上、下游引物各0.5 μL,dd H2O至20 μL。优化判断标准以最小Ct值、最大产物荧光值、特异性单峰等作为指标，选择50～60 ℃对退火温度进行10个梯度的优化。

1.6.2 引物用量的优化采用“1.6.1”的反应体系以及最佳退火温度，选择0.5～1.5 μL间的8个梯度对引物(浓度为10 mol·L-1)的用量进行优化。

条件优化后即建立基于TB Green的检测CKoV核酸的实时荧光定量PCR方法。

1.7 熔解曲线分析和标准曲线的建立

10倍递增稀释CKoV阳性标准品。用“1.6”建立的实时荧光定量PCR方法分别对10-1～10-10递增稀释的标准品进行检测，同文献[23]方法制作标准曲线，并按照以下公式计算出扩增效率，扩增效率(E)=10-1/斜率-1。

1.8 实时荧光定量PCR方法的评价

1.8.1 特异性评价用建立的实时荧光定量PCR方法对常见羊病病原的核酸样本进行检测，以RNase Free ddH2O作为阴性对照。

1.8.2 稳定性评价分别取等量的2.23×104、2.23×105和2.23×106copies·μL-1的重组质粒，按上述方法进行实时荧光定量PCR扩增，每份样品设3个重复，进行批内重复性试验；同取以上3份样品，在相同反应条件下进行3次独立的检测，进行批间重复性试验。

1.8.3 敏感性测定以101～1010稀释度的标准品为模板，以RNase Free ddH2O为阴性对照，按上述方法进行实时荧光定量PCR扩增，每个浓度设3个重复。

1.8.4 4种方法的比较采用所建立的实时荧光定量PCR方法和常用于检测KoV的3种RT-PCR方法[11，13，21]分别平行对24份山羊腹泻粪样本进行检测，比较其检出率，引物信息见表1，全部的阳性PCR产物送生工生物有限公司测序。

1.9 临床样本中CKoV的检测

利用本试验建立的实时荧光定量PCR方法对79份山羊腹泻粪样本进行CKoV的检测，从阳性样本中随机挑选20%进行测序，以验证检测结果的正确性。

1.10 CKoV完整的3D基因序列扩增及分析

自行设计2对引物分段扩增完整的3D基因，引物序列如下，F1:5′-CGTTGTCGGCTCTTCTGGCTTCT-3′,R1:5′- CTATGCGAAAAGCACA- GGAGGGA-3′;(6 500—7 329 nt,GenBank收录号：MT584793);F2′:5′-GTGACGGCGGGAC-TTACCAGAG-3′;R2:5′- GGGTGAAACGCCTGGGAAGAG-3′ (7 083—8 078 nt,GenBank收录号：MT584793)，所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成。分段扩增CKoV阳性样本3D基因，扩增的目的片段经胶回收，连接至pMD19-T载体后，转化到E.coliDH5α感受态细胞中，提取质粒送往上海生工生物有限公司测序。

使用SeqMan software软件拼接3D基因序列，使用DNASTAR7.0软件中的MEGAlign程序测定核苷酸序列和推断氨基酸序列的相似性，使用MEGA 7.0软件以Neighbor-Join法(Bootstrap值为1 000)构建系统进化树。

2 结果

2.1 引物的特异性验证

用自行设计的特异性引物从SWUN/F11/2019毒株cDNA中扩增出预期大小的目的片段(图1)，测序结果证明目的片段长度为176 bp，符合预期结果，与GenBank中CKoV 3D基因的相似性为100%，为CKoV 3D基因的特异序列。

M.DNA相对分子质量标准;-.阴性对照；+.阳性样品M.Gene ruler ultra-low range DNA ladder;-.Negative control；+.CKoV positive sample图1 引物扩增片段电泳鉴定Fig.1 Gel electrophoresis of amplification fragment by specific primers

2.2 优化的实时荧光定量PCR反应体系及条件

优化后的20 μL反应体系：上、下游引物各0.5 μL，模板1.5 μL，TB Green Premix ExTaqⅡ 10 μL，ddH2O补至20 μL。

优化后的反应条件：95 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s、55 ℃ 30 s，40个循环；熔解段95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min、95 ℃ 15 s，循环1次，反应结束。

2.3 标准曲线及熔解曲线

紫外分光光度计测得阳性标准品的浓度为70 ng·μL-1，换算后相应拷贝数为2.23×1010copies·μL-1。按照优化后的反应条件进行反应，本试验建立的方法在阳性模板浓度为2.23×102～2.23×108copies·μL-1之间呈现良好的线性关系(图2 A)，标准曲线为y=-3.110 6x+ 38.09，相关系数R2值为0.999 2，扩增效率为110%。结果说明该方法线性关系良好、扩增效率好。熔解曲线结果(图2 B)显示，PCR产物在87 ℃左右均出现单一波峰，无引物二聚体和非特异扩增峰。用本试验设计的检测引物对同一模板的3次重复检测结果一致，证明该方法有良好的重复性(结果未展示)。

图2 CKoV real-time PCR检测方法的标准曲线(A)及熔解曲线(B)Fig.2 Standard curve (A) and melting curve (B) of real-time PCR for CKoV

2.4 方法的特异性

本试验建立的实时荧光定量PCR方法仅对CKoV具有良好的扩增曲线，不扩增其他无关病原(图3)。

1.CKoV标准品模板；2～13.ORoV、CEoV、CAoV、BAoV、BVDV、BCoV、ETEC K99、山羊源沙门菌、奇异变形杆菌、山羊源志贺菌、枯草芽胞杆菌、粪肠球菌；N.阴性对照1.CKoV positive samples;2-13.ORoV,CEoV,CAoV,BAoV,BVDV,BCoV,ETEC K99,Salmonella,Proteus mirabilis,Shigella,Bacillus subtilis,Enterococcus faecium;N.Negative control图3 实时荧光定量PCR的特异性Fig.3 The specificity test of the real time fluorescent quantitative PCR

2.5 方法的稳定性

本次所建立的实时荧光定量PCR方法批内变异系数CV为0.56%～0.87%，批间变异系数为0.43%～0.86%(表2)，表明该方法的检测稳定性良好。

表2 实时荧光定量PCR方法的稳定性(n=3)Table 2 Stable test of real time fluorescent quantitative PCR (n=3)

2.6 方法的敏感性

将2.23×1010copies·μL-1标准阳性质粒作10倍递增稀释，以101～1010稀释度的标准品为模板进行实时荧光定量PCR检测，同时以等量RNase Free ddH2O代替模板作为阴性对照。结果显示，101～109稀释度范围内均具有特异性扩增曲线，该方法所能检出的最低拷贝数为22.3 copies·μL-1(图4)。

1～10.2.23×109～2.23×100；N.阴性对照1-10.2.23×109～2.23×100；N.Negative control图4 实时荧光定量PCR的敏感性Fig.4 The sensitivity test of the real time fluorescent quantitative PCR

2.7 四种检测方法的比较

4种检测方法对24份山羊腹泻粪样本中CKoV的检测结果见表1，本试验所建方法的检出率明显高于文献里其他3种方法(P<0.05)，且作者建立方法检出的阳性样本包括了其他3种方法所检出的所有阳性样本。本方法检出的全部阳性样本的PCR产物经测序证实均为CKoV的目的基因片段。

2.8 山羊腹泻粪样本中CKoV的检出率

对79份山羊腹泻粪样本的检测结果显示，CKoV平均阳性率为25.3%，平均场阳性率53.3%。四川山羊粪样本中CKoV的检出率为30.84%，场阳性率为57.1%；重庆山羊粪样本中CKoV的检出率为8.6%，场阳性率为33.3%；云南山羊粪样本中CKoV的检出率为100%，场阳性率为100%。随机挑选的20%阳性PCR产物经测序证实均为目的片段，进一步证明该方法检测结果的准确性。

2.9 CKoV 3D完整基因的克隆

从四川和云南共5个山羊养殖场的CKoV阳性粪样本中成功克隆出大小为1 404 bp的13个完整的3D基因，编码468个氨基酸(GenBank登录号:MW187484～MW187496)。这13个3D基因间的核苷酸相似性为99.6%～100%，氨基酸相似性为99.6%～100%，与GenBank中的仅有的3个 CKoV完整的3D基因核苷酸相似性为92.3%～100%，氨基酸相似性为98.5%～100%，与GenBank中11个CKoV 3D基因片段的相似性为70.1～92.9%，氨基酸相似性为83.6～98.4%。

系统发育分析表明，这13株CKoV 3D基因与GenBank中唯一的中国CKoV毒株的3D基因共同聚为单独的一个大支(图5)，表明了国内CKoV 3D基因具有独特的进化趋势。与GenBank中另外2个CKoV完整的3D基因序列相比，14个中国毒株的完整3D基因序列有59个共同的核苷酸突变，其中9个为有义突变，导致了3个氨基酸的突变(E43G、D252E和T368S)。

●.本研究毒株；▲.本实验室前期克隆的1个中国毒株● marks the strain in this study,▲ marks the Chinese strain previously cloned in our laboratory图5 CKoV完整3D基因的邻近法演化树Fig.5 Neighbor-joining consensus tree for CKoV complete 3D gene

3 讨论

KoV是人和多种动物的腹泻病原[2,4-5,18-19]，常用的KoV检测方法的靶基因均为3D基因[8,24-26]。尽管3D基因在KoV成员中相对保守，但也存在遗传多样性，并表现出一定的地域特征[22,24]。研究表明KoV 3D基因核苷酸的平均替换率为2.64×102替换·(位点·年)-1[27]。目前检测CKoV的方法有3篇文献报道[11,13,21]。Melegari等[13]以3D基因为靶基因的特异性检测CKoV的RT-PCR方法，该RT-PCR方法的上游引物(21个碱基)扩增位点在国内唯一上传的1个完整CKoV 3D基因序列的第4位发生突变(T→C)，而下游引物(22个碱基)扩增位点在第2、5、17位发生突变(C→T，G→C，C→T)，这些碱基突变很可能会影响扩增效率。Lee等[11]以人爱知病毒毒株AiV-1和牛嵴病毒毒株U-1 共保守的3D基因设计引物的RT-PCR方法，Reuter等[21]以人爱知病毒毒株AiV-1和牛嵴病毒毒株U-1以及猪嵴病毒S-1-HUN共保守的3D基因设计引物的RT-PCR方法，这两种方法通用引物的扩增位点均与我国毒株不完全匹配，并且均需PCR测序来鉴定种，其特异性也需要进一步验证。本研究根据CKoV流行毒株的3D基因建立了实时荧光定量PCR方法，具有良好的特异性、灵敏性和稳定性，与国外上述3种检测CKoV的RT-PCR方法相比，极大地提高了临床样本中CKoV的检出率，为CKoV的检测和流行病学调查提供了新的技术手段。

CKoV作为山羊新发病毒，其流行病学资料仍然匮乏。本试验用建立的实时荧光定量PCR方法对2020年1—4月四川、云南和重庆共15个山羊养殖场的79份山羊腹泻粪样本进行了检测，山羊CKoV的检出率为25.31%，场阳性率为53.3%，证明该病毒已在上述地区山羊中广泛流行。由于临床样本均来自于山羊腹泻粪样本，未采集山羊健康粪样本作对照，所以CKoV与腹泻之间的关系还需要进一步调查。尽管CKoV的致病性不清楚，但多种KoVs，如人爱知病毒、牛嵴病毒和猪嵴病毒等是导致动物腹泻的重要病原，因此有必要扩大样本进一步调查CKoV在国内的流行情况以及与山羊腹泻间的联系。

目前，GenBank中有3个完整的3D基因，包括本实验室前期上传的1个中国毒株。本研究成功获得了13个国内流行毒株完整的3D基因序列，为CKoV的检测方法的建立和遗传进化分析提供了基础数据。进化分析已有的14个中国毒株完整3D基因的序列，发现这些毒株共同聚为单独的一个大支，与国外毒株具有显著的遗传距离，说明中国毒株具有独特的进化趋势(图5)，这可能与地域、环境和自然选择模式等压力有关[22,27]。3D基因编码区含有高度保守的氨基酸序列KDELR、YGDD 和FLKR，作为病毒依赖RNA的聚合酶在KoV增殖中起关键作用[28]。14个中国株的完整3D基因编码的氨基酸序列与GenBank中另外2个国外3D氨基酸序列相比，有3个共同的氨基酸突变，但它不在RNA的聚合酶区域，这种独特的氨基酸突变是否会影响3D基因的分子功能需要进一步研究。