中国H9N2亚型禽流感病毒的流行现状

孙华鹏，崔新鑫，潘亮奇，许丰祥，李 硕，吴梅花，朱旭辉，于亚南，李明亮，刘 杨，瞿孝云,廖 明,孙海亮

(人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室，岭南现代农业科学与技术广东省实验室，广东省动物源性人兽共患病预防与控制重点实验室，广州 510642)

1992年,H9N2禽流感病毒(AIV)在广东地区首次暴发，随后向其他地区蔓延[1]，1998年，迅速扩散到中国大部分省份[2]，已成为鸡群中流行的禽流感病毒的主要亚型[3]。H9N2 AIV不但给养禽业造成了巨大的经济损失，而且跨宿主传播感染哺乳动物和人，给公共卫生安全构成严重威胁。1998年，从香港地区猪身上分离到H9N2 AIV，随之陆续有猪感染H9N2 AIV的报道[4-7]。1998年，首次出现人感染H9N2 AIV的病例[8]，近年来不断有人感染H9N2 AIV的报道[9-12]，血清学研究结果表明从事家禽行业的人群H9N2 AIV抗体率高达15%[13-15]。据WHO统计，2015年12月—2020年8月28日，中国已经累计33人感染H9N2 AIV。另外，新型H7N9和H10N8 AIV的内部基因均来自H9N2 AIV[16-17]，导致人员感染并引起死亡，给公共卫生安全造成严重威胁。因此，加强对H9N2 AIV的监测，解析病毒致病性和跨宿主传播能力的变化，对于流感病毒的综合防控具有重要意义。

1 当前中国H9N2 AIV 的流行分布

为了解中国H9N2 AIV的流行分布情况，作者对NCBI上2016—2020年，3 014株 H9N2 AIV 的分离时间、地域和宿主进行了分析。结果显示，2016—2020年，中国H9N2 AIV 分布在山东、广东、安徽、广西、湖南、湖北、福建、江西、云南、江苏、浙江、重庆、黑龙江、山西、西藏、青海、宁夏、四川、北京、天津、上海、贵州等地。其中，H9N2 AIV分布较为密集地区为江西、广东、贵州、江苏，其次为云南、上海等(表1)。从病毒的分离来源来看，2016—2020年，中国流行的H9N2 AIV主要来自鸡，少数来自鹌鹑、鸭、鹅，极少数分离自人。

表1 2016—2020年中国H9N2 禽流感病毒流行分布Table 1 Distribution of H9N2 avian influenza virus in China in 2016-2020

2 当前中国H9N2 AIV HA和NA遗传演化分析

H9N2 AIV全球广泛分布，主要分为北美、欧亚两个分支，其中欧亚分支进一步分为BJ/94-like(或Y280-like)、G1-like、Y439-like、F/98-like等[18-19]。在中国，早期H9N2禽流感主要发生在香港和广东地区，1995—2000年传播到内陆地区[20]。参考HA进化分支方法[21]，中国H9N2 AIV主要分布在h9.4.2分支。2007年之前，中国主要流行h9.4.2.1-h9.4.2.4分支的H9N2 AIV，2007年之后，h9.4.2.5分支的H9N2 AIV逐渐成为主流，大约在2010年，h9.4.2.6分支的H9N2 AIV也扩展到全国各地，但是h9.4.2.5分支的H9N2 AIV比h9.4.2.6分支更加普遍[19]。先前H9N2 AIV NA分为BJ/94-like、G1-like和Korea-like 3个分支[22-23]。现在中国流行的H9N2 AIV NA演化为4个分支(Clade 0～3)，并且Clade 2分支的病毒在2010年后占据了主导地位[24]。

为了解中国当前流行的H9N2 AIV的遗传演化情况，对NCBI上2016—2020年中国H9N2 AIV的HA、NA序列进行遗传演化分析，HA系统发育树结果表明，当前中国流行的H9N2 AIV绝大部分毒株隶属于h9.4.2.5分支，极少部分毒株隶属于h9.4.2.1分支，h9.4.2.6分支的病毒已经不再流行 (图1)。NA系统发育树结果表明，当前中国流行的H9N2 AIV绝大部分毒株隶属于BJ/94分支中的Clade 2亚分支(图2)。综上所述，当前中国流行的H9N2 AIV主要为h9.4.2.5分支的病毒。

图1 2016—2020年中国H9N2 AIV HA遗传演化Fig.1 Genetic evolution of H9N2 AIV HA in China from 2016 to 2020

图2 2016—2020年中国H9N2 AIV NA遗传演化Fig.2 Genetic evolution of H9N2 AIV NA in China from 2016 to 2020

3 H9N2禽流感病毒受体结合特性分析

当前H9N2禽流感病毒受体结合特性主要表现为双嗜性和优先结合α-2,6 SA受体，增强了病毒跨宿主传播感染哺乳动物的能力。中国早期的H9N2 AIV优先结合α-2,3 SA受体[25-26]，伴随着病毒的持续流行，病毒的受体结合特性也发生了变化，近些年流行的H9N2 AIV表现出双嗜性，并且结合α-2,6 SA受体的能力高于结合α-2,3 SA受体的能力，或者优先结合α-2,6 SA受体的特性[26-32](表2)。

表2 H9N2 AIV受体嗜性演化情况Table 2 Phylogenetic evolution of H9N2 AIV receptor

HA蛋白的突变会改变病毒与受体的结合嗜性和结合强度。据报道，N313D、N496S、A180T/V、HA2-D46E突变增强病毒与α-2,6 SA和α-2,3 SA受体的能力[26,33-34]。220-loop缺失以及Q226L突变增强病毒与α-2,6 SA受体结合的能力[35-36]，而Q227P突变增强病毒与α-2,3 SA受体结合的能力。Q226L突变可以增强绝大多数H9N2 AIV 结合α-2,6 SA受体的能力，也有一些病毒虽然拥有226L，但是与α-2,6 SA受体的结合能力较差[37-38]。中国2016—2020年流行的H9N2 AIV中，99.5% (2 998/3 014)毒株的HA蛋白第226位为L，这表明当前中国流行的H9N2 AIV普遍增强与α-2,6 SA受体结合的能力，增加病毒跨宿主感染哺乳动物的风险。

4 当前H9N2禽流感病毒抗原性分析

H9N2 AIV持续暴发给养禽业造成了巨大损失，为进一步防控H9N2 AIV，中国自1998年开始使用疫苗[39]。伴随H9N2 AIV持续流行，病毒的抗原也发生了一定的变化。1998—2007年,全国分离的20株H9N2 AIV中，有18株病毒与A/CK/SD/6/96疫苗株的抗血清反应不佳(HI≤640)，有4株2007年的病毒与A/CK/SH/F/98疫苗株抗血清反应较差(HI≤80)[40]。2012—2013年，山东分离的6株H9N2 AIV 与A/CK/GD/SS/94疫苗株抗血清反应较差(HI≤320)，与它们本血清反应良好(HI≥1 280)[41]。2002年和2006—2014年，上海分离的14株H9N2 AIV，虽然起源于A/CK/SH/F/98，但是与其存在抗原距离[42]。对2011—2014年分离的28株H9N2 AIV和疫苗株SH/F/98和GD/SS/94进行分析，结果显示，其中，4株病毒的抗血清与疫苗株H9N2 AIV及大多数分离株的反应较差[43]。对2013—2016年西南地区分离的12株H9N2 AIV与A/CK/GD/SS/94和A/CK/SD/6/96疫苗株进行分析，结果显示，2014—2016年，分离毒株比2013年分离毒株与疫苗株的抗原性差异更显著[44]，2017—2018年，山东地区分离的H9N2 AIV与A/CK/SH/F/98和A/CK/GD/SS/94疫苗株抗血清反应中等或者较差[45]。综上所述，与早期病毒相比，近些年流行的H9N2 AIV已经出现了抗原变异的现象。

HA蛋白是诱导产生中和抗体的主要抗原。H9N2 AIV HA蛋白的一些位点也陆续被揭示与抗原变异相关。Kaverin定义了两个抗原位点，位点Ⅰ(147、165、170)，位点Ⅱ(145、197、206)，以及重叠位点(153、201、234)[46]。Wan等[47]揭示了两个独立的抗原位点“H9-1”(147、164、167、168)和 “H9-2”(153、196、200、201、207)。HA 蛋白218位糖基化位点缺失，同时，313位糖基化位点的出现增加了病毒与抗体的结合，中度阻止了病毒对同源抗血清中和作用的逃逸[48]。HA 蛋白N166D突变降低了病毒对鸡的免疫原性[49]，而D200N突变提高了病毒与单克隆抗体的反应滴度[50]，N166D突变降低病毒鸡的弱抗体反应。另外，92、90、166、133、138、141、143、149、157、180、230、234、252等位点也被证实与抗原相关[46,51-54](表3)。

表3 2016—2020年中国H9N2 AIV HA蛋白关键位点氨基酸的自然突变Table 3 Natural mutations of amino acids at key sites of H9N2 AIV HA protein in China from 2016 to 2020

为了解中国当前H9N2 AIV抗原变异情况，对NCBI上2016—2020年中国H9N2 AIV序列进行分析，结果显示，在已经报道的抗原位点中，除了165和170位点的氨基酸比较保守外[46,52]，其他位点的氨基酸都出现了多态性，其中，90、141、143、147、163、234、235位点的氨基酸呈现双态性，剩余位点的氨基酸为3态及以上。218和313糖基化位点的缺失也改变病毒的抗原。综上所述，当前中国H9N2 AIV的抗原正在发生着改变。

5 H9N2禽流感病毒的致病性

当前，H9N2 AIV持续在鸡群暴发,给养禽业造成了巨大损失。H9N2为低致病性AIV，但近年来，致病性和跨宿主传播能力呈现出增强的趋势，出现了感染猪和人的案例，给公共卫生安全带来一定的挑战。早期的H9N2 AIV毒株感染鸡，主要在呼吸道复制，偶尔可以从泄殖腔拭子中检测到病毒，只具有通过直接接触方式在鸡群中传播的能力，1998年的毒株具备了通过气溶胶在鸡群中传播的能力[55]。

2013—2015年的 H9N2 AIV，泄殖腔排毒的能力增强，通过泄殖腔的排毒量明显高于通过口咽，感染鸡群表现临床症状，随之出现死亡现象。病毒除了在呼吸道复制以外，还可以在脾、肝、肾和脑中复制[31,56]。2017年的毒株可导致小家禽(鹌鹑)的喉头、气管、肺和心出现较为严重的病理损伤[57](表4)。

H9N2 AIV对哺乳动物的致病性也在发生变化。H9N2 AIV感染小鼠后，主要在肺进行复制，引起肺的病理变化，并引起小鼠体重的减轻，有些病毒还可以在鼻甲中进行复制[28,31,58-60]。H9N2 AIV感染豚鼠后，可以通过鼻腔向外排毒，但不具备通过直接接触方式进行传播的能力[26,31]。H9N2 AIV感染雪貂，主要在鼻甲、气管和肺等呼吸道复制，有的病毒还可以在脾中复制[28](表4)。H9N2 AIV的某些蛋白发生突变，增强了病毒在哺乳动物细胞上的复制能力，增强病毒对哺乳动物的致病性。PB2蛋白E627K突变增强病毒对小鼠的致病性，Q591K突变增强病毒对小鼠的致病性，增强病毒在人气管上皮细胞的复制能力，D195N、I292V、D253N突变增强病毒在人胚胎肾细胞(293T)或者人肺癌细胞(A549)上的复制能力[26,61-64]。PB1蛋白K577E突变增强病毒对小鼠的毒力以及在293T细胞上的聚合酶活性。PA蛋白K356R突变增强病毒对小鼠的致病性以及在A549和MDCK细胞上的复制能力[67]。HA蛋白N132D、N198S、T190V突变增强病毒对小鼠的毒力[27,61]。HA2蛋白D46E增强病毒的热稳定性，致使病毒具备了通过直接接触方式在豚鼠间进行传播的能力。HA1蛋白Q227P和NP蛋白E434K突变，增强了病毒在293T细胞上的聚合酶活性，促使病毒可以通过直接接触方式在豚鼠间传播[26](表5)。

表4 H9N2 AIV的致病性变化Table 4 Pathogenicity changes of H9N2 AIV

表5 突变对H9N2 AIV复制及致病性的影响Table 5 Effects of mutation on replication and pathogenicity of H9N2 AIV

作者对NCBI上2016—2020年中国H9N2 AIV序列进行分析，结果显示，PB2蛋白第292位氨基酸为V的比例为87%(34/154)，第195位氨基酸为N和第627位氨基酸为K的比例均为1.3%(2/154)；PA蛋白第356位氨基酸为R的比例为94.2%(47/154)；HA蛋白第190位氨基酸为V的比例为2.8%(85/3 014)。这表明，当前中国流行的H9N2 AIV PB2、PA和HA蛋白获得了一定的适应性突变，增强了在哺乳动物细胞上的复制能力，增强对小鼠的致病性，增加了跨宿主传播甚至感染人的风险。

6 小结与展望

H9N2 AIVs不断发生变异和重组，受体结合特性趋于双嗜性或者优先结合人类受体，致病性有增强的趋势，抗原特性也在发生着改变，增加了跨宿主传播甚者感染人的风险。目前，疫苗接种仍然是防控AIVs的主要手段。但是近年来出现了H9N2疫苗免疫后仍然排毒的情况，这使得H9N2 AIVs的防控变得更为棘手。一方面，可以通过遴选新抗原毒株、研制新型疫苗，开发新型佐剂等，提高H9N2疫苗的免疫效果。另一方面，应该强化生物安全防控理念，提高生物安全防控技术，采用生物安全防控手段控制疾病的发生。切实做好H9N2 等低致病性AIVs的防控，保障养禽业的健康发展和公共卫生的安全。