右旋美托咪定抑制胰岛素样生长因子2通路对卵巢癌大鼠免疫功能和癌细胞侵袭迁移的影响及调控机制研究①

2021-05-28陈飞任黎真真吴红发海口市妇幼保健院麻醉科海口571400

中国免疫学杂志 2021年7期

陈飞任陈扬黎真真远征吴红发（海口市妇幼保健院麻醉科，海口571400）

近年来，卵巢癌发病率和患病率持续增高，主要治疗方法是根治性切除，对于大多数患者而言疗效较好［1-2］。但手术过程中麻醉药的不正确使用可导致患者生命体征不稳定，甚至呼吸抑制和其他不良反应［3］。因此，选择合适的麻醉药已成为卵巢癌根治术成功与否的关键［4］。铂类药物化学疗法的最佳减量化仍然是卵巢癌治疗的基础，但复发率较高［5］。研究证实，卵巢癌患者免疫系统功能被抑制，免疫活性因子和细胞功能降低，进一步引发肿瘤细胞生长和迁移［6］。右美托咪定是临床常用镇静药，是具有高度选择性的α2肾上腺素能受体激动剂，可与脊髓和脑干核小脑中的α2受体结合，起镇痛和抗焦虑作用［7］。与镇静药物（如丙泊酚和芬太尼）相比，右旋美托咪定的优势在于不会引起患者呼吸抑制［8］。目前，关于右旋美托咪定在麻醉、镇静和器官保护方面的研究较多，但在肿瘤治疗方面的研究较少。胰岛素样生长因子2（insulin-like growth factor 2，IGF2）信号通路是癌症发生发展过程中的重要通路［9］。IGF2信号通路及其关键蛋白在顺铂耐药卵巢癌中起主要作用［10］。但IGF2信号通路是否受相关药物影响，以及是否影响肿瘤的生物学特性尚未明确。基于药物治疗的分子机制，本研究探讨右旋美托咪定通过IGF2通路对卵巢癌大鼠免疫功能和肿瘤细胞侵袭、迁移的影响及机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物与细胞了来源 30只清洁雌性Fischer 344大鼠购自动科院研究所，10～12周龄，体重（150±10）g，饲养适应期1周；低分化的上皮卵巢癌细胞系NUTU-19购自中国上海乔都生物技术有限公司，每24 h换液1次培养，每2 d传代1次。

1.1.2 主要试剂与仪器右旋美托咪定（Cisen Pharmaceutical Co，Ltd）；无血清培养基（YB356234，上海裕博生物技术有限公司）；TRIzol试剂（美国In‐vitrogen公司）；RT-PCR试剂（SYBRGreen）；HE染色试剂（SBT10001，北京索拉尔生物技术有限公司）；PI（107-21-1，天津鼎盛鑫化学工业有限公司）；LPS（美国Sigma Corporation）；ELISA试剂盒（PH029 RAT，上海Phygene）；BCA蛋白质测定试剂盒、MTT试剂（南京建成生物工程研究所有限公司）；ABI PRISM 7300系统（美国Applied Biosystems）；酶标仪（可孚医疗科技发展有限公司）；倒置显微镜（德国Leica）。

1.2 方法

1.2.1 造模与分组选取20只大鼠建立卵巢癌大鼠模型。将对数生长期的NUTU-19低分化上皮性卵巢癌细胞浓度调整为2×107个/ml，皮下接种细胞悬液于大鼠右腋（0.5 m/l只）。大鼠毛发干燥、体重明显减轻且身体活动减少视为造模成功。当右腋下肿瘤长至0.4 cm×0.4 cm时，将大鼠分为2组：模型组和右旋美托咪定治疗组［4.5μg/（kg·h）］，右旋美托咪定治疗组通过腹膜内注射右旋美托咪定，1 d/次，持续15 d，正常组和模型组大鼠注射等量生理盐水。本研究经医院伦理委员会批准，动物实验方案经动物研究伦理委员会批准。

1.2.2 RT-qPCR 收集组织置于预冷的裂解缓冲液中冰上裂解，收集上清。采用TRIzol试剂提取总RNA，逆转录为cDNA，以GAPDH为内参，共合成50 ng总RNA，进行PCR反应，反应体系50μl，包括2 mmo/lL dNTP mixture 2μl，Buffer 5μl，Tag酶0.4μl，引物2μl，DNA模板4μl和ddH2O 36.6μl，采用ABIPRISM 7300系统进行RT-qPCR反应。

1.2.3 Western blot 取大鼠卵巢组织，PBS洗涤2次，液氮中研磨，冰浴中采用苯甲基磺酰氟（PMSF）溶液（RIPA：PMSF=100：1）通过放射免疫沉淀测定RIPA裂解缓冲液裂解，每5 min摇动1次以确保细胞完全裂解，4℃、12 000/rmin离心30 min，吸取上清至新的EP管中，BCA法测定蛋白浓度。上清体积记录为V，取1/3 V 4×上样缓冲液至EP管中，浸入100℃ 金属浴中10 min，-20℃保存备用。取20μg蛋白与加样缓冲液混合，变性并加至10%SDS-PAGE凝胶的各泳道中。将转移至PVDF膜上的蛋白在5%脱脂牛奶中22℃封闭1 h，凝胶记录和分析系统拍照，Adobe Photoshop 7.0.1版软件测量条带强度，并对β-肌动蛋白表达进行标准化以进行定量分析。

1.2.4 HE染色第25天处死大鼠，取卵巢和卵巢癌组织，放入10%甲醛中固定24 h，石蜡包埋，60℃切片（5μm），60℃放置1 h，二甲苯脱蜡，重新水化，HE染色，显微镜下观察肿瘤组织形态变化。

1.2.5 MTT测定脾淋巴细胞增殖率颈脱位法处死大鼠，浸入0.5%碘伏溶液中5 min，无菌条件下取出大鼠各脾脏，切薄片，PBS中研磨，200目筛过滤，悬浮，1 500/rmin离心10 min，稀释至2×106个/ml，置于96孔板。在前3块板中添加100μl LPS（10 g/ml）作为实验板，最后3块板添加100μl RPMI1640培养基作为对照板，37℃、5%CO2培养48 h，结束前4 h弃100μl上清，加入20μl MTT溶液（5 mg/ml）混合，培养4 h，100μ/l孔加入DMSO，30 min后采用ELx800微孔板读数器测量490 nm处光密度（OD）值，酶标仪测定570 nm处OD值。

1.2.6 流式细胞术测定CD4+和CD8+T细胞百分比及细胞周期麻醉大鼠，腹主动脉取血，10 000/rmin离心5 min，弃上清，清洗2次，与5 ml 70%乙醇混合，4℃ 培养48 h，PBS清洗，重悬于1 ml PBS中，加入5μl RNase（10 mg/ml）37℃ 孵育1 h。加入碘化丙锭（100μg/ml）室温避光染色30 min，流式细胞术检测CD4+和CD8+T细胞百分比并计算CD4+与CD8+T细胞比例。收集细胞，冷PBS洗涤并离心，重悬至终浓度为1×105个/ml，4℃与1 ml 75%预冷乙醇固定1 h，离心，PBS洗涤，37℃下加入100 ml RNase A处理30 min，加入400μl PI于4℃染色30 min，488 nm处检测到红色荧光，流式细胞术分析细胞周期。

1.2.7 ELISA 实验结束时，大鼠眼球取血，3000/rmin 4℃下离心15 min分离血清。然后收集血清并储存在-20℃。根据ELISA试剂盒说明书测量大鼠血清中IL-2和TNF-含量，各实验重复3次。

1.2.8 Transwell试验将200μl Matrigel添加到4℃200μl无血清培养基中，将50μl Matrigel添加到Transwell小室中孵育2～3 h，消化并计数，2%含血清培养基制备细胞悬液，将200μl细胞悬液添加到各孔Transwell小室。设置右旋美托咪定低、中、高剂量组（终浓度分别为1、10、100 ng/ml），并将含有20%FBS的800μl条件培养基添加到空白组培养板中，将Transwell板37℃ 孵育24 h，PBS漂洗3 min，浸入甲醛中10 min，水洗3次，3 min/次，0.1%结晶紫染色，室温放置1 h，PBS冲洗2次，棉球擦拭细胞，风干，倒置显微镜下观察，随机选取5个字段，计算平均值。

1.2.9 刮擦黏附试验 12孔板后每0.5 cm处画水平线以确保至少有5条线穿过各孔，加入约5×105个细胞以确保该板过夜铺展。第2天，采用直尺进行刮擦黏附力测试，最大限度地确保移液器吸头垂直于板的背面进行刮擦测试，避免板倾斜，PBS冲洗3次，1 min/次，除去交叉细胞。右旋美托咪定低、中、高剂量组终浓度分别为1、10、100 ng/ml，空白组加入等量生理盐水，各组细胞均在37℃、5%CO2中培养，0 h和48 h取样，拍照并分析划痕宽度以评估细胞迁移情况。

1.3 统计学分析采用SPSS21.0软件进行统计学分析，所有数据以±s表示，多组间采用方差分析，两组间比较采用t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 卵巢组织中IGF2、IGF1R和IRS1 mRNA表达 RT-qPCR显示，与对照组相比，模型组、右旋美托咪定治疗组IGF2、IGF1R和IRS1 mRNA表达升高，与模型组相比，右旋美托咪定治疗组IGF2、IGF1R和IRS1 mRNA表达降低（P＜0.05，表1）。

2.2 右旋美托咪定抑制p38MAPK/NF-κB信号通路激活如图1所示，Western blot检测大鼠组织样本中p38MAPK/NF-κB信号通路蛋白表达结果显示，与对照组相比，模型组和右旋美托咪定治疗组p38、NF-κB蛋白表达升高，与模型组相比，右旋美托咪定治疗组p38、NF-κB蛋白表达降低（P＜0.05）。

表1 卵巢组织中IGF2、IGF1R和IRS1 mRNA表达（±s）Tab.1 IGF2，IGF1R and IRS1 mRNA expressions in ovarian tissue（±s）

Note：Compared with Control，1）P＜0.05；compared with Model，2）P＜0.05.

GroupsIGF2IGF1RIRS1 Control1.02±0.180.86±0.211.11±0.25 Model2.26±0.351）1.98±0.311）2.12±0.331）Dexm tr ee d at emt oemn it dine1.54±0.241）2）1.25±0.221）2）1.68±0.191）2）F 9.13511.68210.731 P 0.0180.0360.004

图1 Western blot检测p38、NF-κB蛋白表达Fig.1 Western blot analysis of p38 and NF-κB protein ex⁃pressions

2.3 右旋美托咪定对卵巢癌大鼠血清CD4和CD8 T细胞百分比的影响与对照组相比，模型组和右旋美托咪定治疗组CD4和CD8 T细胞亚群百分比降低，CD4+/CD8+比值降低，与模型组相比，右旋美托咪定治疗组CD4和CD8 T细胞亚群百分比升高，CD4/+CD8+比值升高（P＜0.05，表2）。

2.4 HE染色观察大鼠卵巢组织变化如图2所示，对照组卵巢组织仅有1个扁平或立方的上皮，底部有1个致密的纤维组织。模型组卵巢组织呈现卵圆形肿瘤细胞，细胞核扩大，细胞核数增加，核仁染色较深。右旋美托咪定组中观察到变种组织，肿瘤体积不同程度缩小，肿瘤发展被抑制。

表2 右旋美托咪定对卵巢癌大鼠血清CD4和CD8 T细胞百分比的影响（±s）Tab.2 Effect of dexotomidine on percentage of serum CD4 and CD8 T cells in rats with ovarian cancer（±s）

Note：Compared with Control，1）P＜0.05；compared with Model，2）P＜0.05.

GroupsCD4（+%）CD8+（%）CD4/+CD8+Control196.37±18.47106.84±12.652.47±0.41 Model65.24±5.261）25.14±3.291）1.12±0.151）Dexm tr ee da e tm to e mnitd ine137.54±8.061）2）76.33±6.081）2）1.84±0.271）2）F 12.6329.03811.728 P 0.0020.0210.035

图2 HE染色Fig.2 HE staining

表3 促炎细胞因子水平（±s，pg/ml）Tab.3 Proinflammatory cytokine levels（±s，pg/ml）

Note：Compared with Control，1）P＜0.05；compared with Model，2）P＜0.05.

GroupsIL-2TNF-α Control41.68±5.2698.71±16.42 Model138.29±21.571）237.65±45.161）Dexmedetomidinetreatment84.68±15.741）2）141.37±25.081）2）F 11.69210.928 P 0.0170.035

2.5 促炎细胞因子水平与对照组相比，模型组与右旋美托咪定治疗组血清IL-2和TNF-α水平升高（P＜0.05），与模型组相比，右旋美托咪定治疗组IL-2和TNF-α水平降低（P＜0.05，表3）。

2.6 右旋美托咪定抑制卵巢癌细胞迁移侵袭Transwell试验及刮擦黏附试验结果显示，与NUTU-19细胞相比，右旋美托咪定治疗组细胞迁移率、侵袭率降低（P＜0.05）。提示右旋美托咪定可抑制卵巢癌细胞迁移侵袭（图3、表4）。

2.7 右旋美托咪定促进脾淋巴细胞生长如表5所示，MTT检测各组细胞脾淋巴细胞增殖率结果显示，第48 h，模型组较右旋美托咪定治疗组脾淋巴细胞增殖率降低，右旋美托咪定治疗组较对照组脾淋巴细胞增殖率降低（P＜0.05），第72 h，模型组较对照组增殖率降低，右旋美托咪定治疗组较模型组增殖率降低（P＜0.01）。

图3 细胞侵袭与迁移Fig.3 Cell invasion and migration

表4 右旋美托咪定对卵巢癌细胞迁移侵袭的影响（±s，%）Tab.4 Effect of dexmedetomidine on migration and inva⁃sion of ovarian cancer cells（±s，%）

GroupsMigration cellInvasion cells NUTU-1973.62±6.1983.62±7.41 Dexmedetomidine treatment31.74±4.6143.28±5.61 t 9.73111.928 P 0.0220.015

表5 细胞增殖率（±s，%）Tab.5 Cell proliferation rate（±s，%）

Note：Compared with Control，1）P＜0.05；compared with Model，2）P＜0.05.

Groups48 h72 h Control0.86±0.221.44±0.32 Model0.26±0.061）0.61±0.211）Dexmedetomidine treatment0.64±0.191）2）1.25±0.251）2）F 9.28711.421 P 0.0160.001

3 讨论

研究表明，IGF在调节卵巢癌细胞增殖和生长方面起关键作用［11］。IGF有2种，IGF-1和IGF-2，均存在于正常卵巢中，参与卵巢表面上皮生长调节过程，与卵巢癌变相关。IGF可通过与IGF-1R结合促进细胞自身合成和分泌IGF，通过自分泌作用刺激细胞增殖。右旋美托咪定是高选择性的肾上腺素能激动剂，作为抗焦虑、镇静、止痛类药物广泛用于重症监护病房和外科治疗。研究报道，右旋美托咪定可降低甲状腺癌患者血清IL-6，IL-8和TNF-α水平，减轻中枢神经系统炎症损伤，对术后认知功能恢复具有重要意义［12］。本研究发现，右旋美托咪定可改善卵巢癌大鼠免疫功能，适量的右旋美托咪定有助于减少卵巢癌患者肿瘤细胞侵袭和迁移。流式细胞术检测结果表明，与模型组相比，右旋美托咪定治疗组组血清T淋巴细胞亚群CD4+和CD8+百分比提高，提示右美托咪定可抑制手术应激反应引起的细胞免疫功能降低。IL-2是人体内常见细胞因子，而CD4+、CD8+T细胞是IL-2的重要组成部分，也是免疫功能调节的重要因子［13-14］。脾淋巴细胞转化率已被证明是维持淋巴细胞和免疫功能的重要因子［15-16］。本研究进一步证实，右旋美托咪定对改善卵巢癌大鼠的免疫功能具有重要作用，对卵巢癌大鼠脾淋巴细胞转化率具有积极作用。本研究显示，右旋美托咪定组术后IL-2和TNF-α水平降低，提示右美托咪定可减轻卵巢癌术后应激所致的不良反应，且对机体状况无影响。

化学抗性和细胞损伤主要由有丝分裂原激活的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号传导途径介导，磷酸化MAPK可增加对化疗的抵抗力，而p38MAPK最为重要［17-18］。核因子-κB（NF-κB）与多种癌症相关，可调节多种细胞过程中重要的多种基因表达，如NF-κB可通过诱导炎症介质产生导致抗凋亡基因表达水平上升，从而刺激细胞增殖及结肠炎相关大肠癌等疾病中血管生成导致肿瘤发生［19］。NF-κB在各种肿瘤细胞系中被组成性激活，影响癌症进展和化疗敏感性，以及对腹膜炎症和与卵巢癌相关微环境的作用［20］。本项研究旨在评估右旋美托咪定对p38MAPK/NF-κB信号通路的抑制作用及其对卵巢癌免疫力和肿瘤生长的影响的相关性，结果表明，右旋美托咪定可抑制p38MAPK/NF-κB信号通路激活并改善卵巢癌的治疗结果及其涉及p38MAPK/NF-κB信号通路激活的潜在机制，与对照组相比，模型组中p38和NF-κB蛋白表达增加，右旋美托咪定治疗组中，p38和NF-κB蛋白表达下降，表明右旋美托咪定对p38和NF-κB蛋白合成和分布具有一定调节作用，与划痕实验及侵袭实验结果一致。因此，课题组推测卵巢组织中p38和NF-κB蛋白表达可能增加，而右旋美托咪定可抑制p38和NF-κB蛋白表达，进而抑制细胞侵袭和迁移。

IGF2信号通路在肿瘤细胞黏附过程中起重要作用，IGF2上调进一步激活IGF1R和INSR表达。一项针对前列腺癌的研究发现，抑制IGF1R和INSR表达可提高前列腺癌患者化疗敏感性。本研究中，qRT-PCR和Western blot结果表明，卵巢癌大鼠中卵巢组织中IGF2信号通路被激活，IGF1R和INSR表达增加，给予右旋美托咪定治疗后，相关指标下调，信号通路被抑制。细胞实验进一步证实了右旋美托咪定可促进脾淋巴细胞增殖，并抑制卵巢癌大鼠癌细胞侵袭和迁移方，作用机制可能有以下2方面：右旋美托咪定可减少交感神经活动抑制手术创伤；术前先发性镇痛作用可缓解或消除手术应激反应，缓解免疫功能抑制。

综上所述，右旋美托咪定在卵巢癌治疗中具有重要价值，右旋美托咪定可通过有效抑制IGF2信号通路活化，降低p38、NF-κB蛋白表达和血清IL-2和TNF-α水平，从而改善卵巢癌大鼠免疫功能和抑制卵巢癌细胞侵袭和迁移。