基于Sonic Hedgehog通路探讨复方胃炎合剂干预慢性萎缩性胃炎癌前病变的机制

黄铭涵　李思汉　田琳　林平　郑榕　施婧瑶　林秀明

〔摘要〕 目的 观察复方胃炎合剂对慢性萎缩性胃炎癌前病变（precancerous lesions of gastric cancer， PLGC）脾虚痰湿热瘀证大鼠 Sonic Hedgehog （Shh）通路相关基因表达的影响，并探讨其抑制PLGC进展的机制。方法 SPF级雄性Wistar大鼠随机分为空白组、空白+中药组、模型组、维酶素组、中药低剂量组、中药中剂量组和中药高剂量组，每组8只。造模组采用复合造模法构建PLGC脾虚痰湿热瘀证大鼠模型，造模成功后，各组予以相应干预，干预30 d后进行标本采集，采用HE染色检测大鼠胃黏膜病变情况，RT-qPCR检测胃组织Shh通路相关基因SHH、PTCH1、SMO、Gli1、Gli2、Gli3 mRNA 的表达。结果 HE染色提示空白组和空白+中药组大鼠胃组织病理组织学正常，模型组大鼠胃黏膜萎缩，并可见肠上皮化生（intestinal metaplasia， IM）和上皮内瘤变（intraepithelial neoplasia， IN）;维酶素组和中药各剂量组病理组织学可见不同程度改善，以中药中、高剂量组改善最为明显。与空白组比较，模型组大鼠SHH、SMO、PTCH、Gli1 mRNA表达量下降，Gli2、Gli3 mRNA表达量上升，差异均有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。与模型组比较，各治疗组大鼠胃组织SHH、SMO、PTCH、Gli1 mRNA表达量均上升，Gli2、Gli3 mRNA表达量均降低，其中空白+中药组、维酶素组、中药中剂量组、中药高剂量组SHH、SMO、PTCH mRNA表达差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01），中药高剂量组大鼠胃组织Gli1 mRNA表达差异有统计学意义（P<0.05），空白+中药组、维酶素组、中药中剂量组、中药高剂量组大鼠胃组织Gli2 mRNA表达差异有统计学意义（P<0.01），中药各剂量组Gli3 mRNA表达差异无统计学意义（P>0.05）。结论 复方胃炎合剂可通过激活Shh通路改善胃黏膜病變，从而抑制PLGC的进展。

〔关键词〕 慢性萎缩性胃炎癌前病变;复方胃炎合剂;Sonic Hedgehog通路;机制研究;大鼠

〔中图分类号〕R259       〔文献标志码〕A       〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.02.013

〔Abstract〕 Objective To observe the effect of compound gastritis mixture on the related genes expression of Sonic Hedgehog （Shh） pathway in rats with spleen deficiency， dampness-heat and blood stasis syndrome of precancerous lesions of gastric cancer （PLGC）， and to explore its mechanism of inhibiting the progression of PLGC. Methods SPF male Wistar rats were randomly divided into the blank group， the blank + traditional Chinese medicine （TCM） group， the model group， the vitacoenzyme group， the low-dosage TCM group， the medium-dosage TCM group， and the high-dosage TCM group， with 8 rats in each group. The rat model of spleen deficiency， dampness-heat， and blood stasis syndrome of PLGC was established by compound modeling method. After the model was successfully established， each group was given 30 days of related interventions. Then， stomach specimens were collected and the pathological changes of gastric mucosa were detected by HE staining， and the related genes expression of Shh pathway of SHH， PTCH， SMO， Gli1， Gli2 and Gli3 mRNA in gastric tissue was detected by RT-qPCR. Results HE staining showed that the histopathology of gastric tissue in the blank group and the blank + TCM group was normal， however， atrophy， intestinal metaplasia （IM） and intraepithelial neoplasia （IN） could be seen in the gastric mucosa of rats in the model group; the histopathology of the vitacoenzyme group and each dose of TCM group were improved in varying degrees， especially in the medium-dosage TCM group and the high-dosage TCM group. Compared with the blank group， the expressions of SHH， SMO， PTCH and Gli1 mRNA in the model group decreased， while the expressions of Gli2 and Gli3 mRNA increased， and the differences were statistically significant （P<0.05， P<0.01）. Compared with the model group， the expressions of SHH， SMO， PTCH and Gli1 mRNA in gastric tissue of rats in each treatment group increased， while the expressions of Gli2 and Gli3 mRNA decreased， among them， there were significant differences in the expressions of SHH， SMO and PTCH mRNA in the blank + TCM group， the vitacoenzyme group， the medium-dosage TCM group， and the high-dosage TCM group （P<0.05， P<0.01）， there were significant difference in the expression of Gli1 mRNA in gastric tissue of rats in the high-dosage TCM group （P<0.05）， the expression of Gli2 mRNA in gastric tissue of rats in the blank + TCM group， the vitacoenzyme group， the medium-dosage TCM group， and the high-dosage TCM group was decreased significantly （P<0.01）， while the expression of Gli3 mRNA in each dosage TCM group was not statistically significant （P>0.05）. Conclusion Compound gastritis mixture can improve the pathological change of gastric mucosa by reactivating Shh pathway， thus inhibiting the progression of PLGC.

〔Keywords〕  precancerous lesions of gastric cancer; compound gastritis mixture; Sonic Hedgehog pathway; mechanism research; rat

胃癌是一种严重威胁人类健康的恶性肿瘤，其发病率和死亡率居我国消化系统恶性肿瘤之首，胃镜检出率为7.5%～13.8%[1]。慢性萎缩性胃炎癌前病变（precancerous lesions of gastric cancer， PLGC）是指在慢性萎缩性胃炎基础上胃黏膜的异常改变，主要包括胃黏膜不完全型肠上皮化生和中、重度不典型增生[2]。目前，多数研究者认同的演变模式为：慢性胃炎→胃黏膜萎缩→肠上皮化生（intestinal metaplasia， IM）→上皮内瘤变（intraepithelial neoplasia， IN）→胃癌[2]。因此，阻断或逆转PLGC进展是降低胃癌发生率的有效措施。复方胃炎合剂是在国医大师杨春波教授创制的“胃炎1号”[3]“胃炎合剂”[4]基础上，结合中医证素研究[5]优化而成，临床治疗PLGC疗效显著[6]。相关研究[7-8]证实，Sonic Hedgehog（Shh）信号通路分子的异常表达与PLGC的发生、进展关系密切。因此，本文以Shh信号通路為切入点，研究复方胃炎合剂阻断或逆转PLGC进程的作用机制，以期为复方胃炎合剂的临床应用提供依据。

1 实验材料

1.1  动物

选择健康Wistar大鼠59只，雄性，体质量为（110±10） g，SPF级，购于上海莱斯克实验动物有限公司[动物许可证号SCXK（沪）2017-0005]，饲养于福建中医药大学SPF级动物实验中心，分笼饲养，环境温度21～25 ℃，空气湿度50%～60%。所有实验均按照福建中医药大学附属第二人民医院伦理委员会和国际动物福利标准的指导方针进行[9]。

1.2  药物

复方胃炎合剂汤药由福建中医药大学附属第二人民医院药剂室制备。复方胃炎合剂由14味药物组成：炙黄芪150 g，党参100 g，茯苓150 g，炒白术100 g，枳壳60 g，白芍100 g，砂仁45 g，法半夏100 g，佩兰100 g，黄连30 g，地龙干150 g，莪术60 g，陈皮60 g，甘草30 g。将药物浸泡于8倍量水中0.5 h，随后煎煮3次，时间分别为1.5、1.0、0.5 h，合并煎液并过滤。在60～70 ℃下减压浓缩滤液至500 mL，含生药2.47 g/mL，灭菌分装，冷藏至4 ℃备用。维酶素片（规格0.2 g/片，北海阳光药业有限公司，批号：190105）;盐酸雷尼替丁胶囊（规格0.15 g/粒，赛诺菲杭州制药有限公司，批号：4061）。

1.3  主要试剂

1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍（货号M0527）购自北京百灵威科技有限公司;TRNzol总RNA提取试剂盒（货号DP424）购自北京天根生化科技有限公司;去基因组逆转录试剂盒（货号RR047B）、荧光定量混合液（货号RR82LR）、DNA梯度标志物（货号3427Q）均购自日本宝日医生物技术（北京）有限公司;引物购自美国Invitrogen公司，引物序列见表1。

1.4  主要仪器

低温冷冻离心机（德国Eppendrof公司，型号5424R）;涡旋振荡仪（海门市其林贝尔仪器制造有限公司，型号QL-902）;分光光度计（美国Thermo scientific公司，型号NANODROP 2000）;荧光定量PCR仪（美国Applied Biosystems公司，型号ABI7500）;紫外分光光度计（美国NanoDrop公司，型号ND-2000）;凝胶成像系统（上海天能科技有限公司，型号Tanon 1600）。

2 实验方法

2.1  模型构建

2.1.1  疾病模型构建  造模组参考文献[10-12]加以改进进行造模：（1）以120 μg/mL 1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍溶液作为饮用水自由饮用;（2）雷尼替丁0.03 g/（kg·d）灌胃;（3）45%乙醇空腹灌胃，每周2次，2 mL/次;（4）每周禁食1次，每次24 h。以上述方法连续造模24周。造模结束后，随机抽取3只大鼠麻醉，取胃，行病理检查，如病理由高年资病理科医师审阅复核，提示胃组织黏膜萎缩，同时见IM和IN，则判断PLGC模型构建成功[11]。

2.1.2  证候模型构建  PLGC造模成功后，课题组参考文献[13-14]加以改进。造模组大鼠单日禁食、自由饮水，双日足量高脂高糖饮食、20%蜂蜜水自由饮用，隔日上午灌服油脂l0 g/（kg·d），下午灌服56°白酒10 mL/kg;第15天开始放入人工气候箱中，温度30～34 ℃，相对湿度95%，连续5 d。经以上造模干预，造模组大鼠背毛蓬松、色偏黄、无明显光泽，喜扎堆，唇周色暗，小便量多色黄，大便便溏或黏稠发暗、馊臭明显，舌质稍紫，尾色瘀青，符合脾虚痰湿热瘀证的模型特点。

2.2  分组及干预

Wistar大鼠采用随机数字法分为2组。空白对照组16只，随机分为空白组、空白+中药组，每组8只，给予SPF级动物标准饮食喂养。造模组43只，按“2.1”方法构建模型后选取40只大鼠，随机分为模型组、维酶素组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组，每组8只。参考成人平均体质量60 kg，根据临床用药剂量与动物用量的剂量换算，中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组、空白+中药组大鼠，每日以复方胃炎合剂原液灌胃，量分别为2.5、5、10、10 mL/（kg·d），根据大鼠体质量用生理盐水稀释药液至每次5 mL/只。维酶素组大鼠予以维酶素混悬液灌服，根据大鼠体质量，按0.2 g/（kg·d）灌胃，每次5 mL/只。空白组、模型组给予生理盐水灌胃，每次5 mL/只。药物干预共30 d。

2.3  标本采集

药物干预结束后，大鼠予禁食12 h，随后放入大小适中、放有乙醚棉球的透明玻璃罩中进行麻醉。麻醉成功后沿腹部正中线剖开腹腔，分离胃，沿胃大弯剖开，放入生理盐水漂洗，取幽门与前胃和腺胃交界线连线的2/5部分，放入冻存管后立即置于液氮中速冻，随后-80 ℃冻存备用;将胃窦部放入10%福尔马林液中固定备用。

2.4  指标检测

2.4.1  HE染色观察病理组织学改变  胃窦部经石蜡包埋后，用切片机连续切片5张，进行HE染色，光学显微镜下观察各组大鼠胃黏膜病理组织学情况。

2.4.2  RT-qPCR检测相关mRNA表达  采用 TRNzol总RNA提取试剂盒进行样本RNA提取，使用紫外分光光度计，采用紫外吸收法进行RNA浓度和纯度测定，再采用去基因组逆转录试剂盒进行cDNA反转录，实验操作严格按产品说明书进行，PCR反应条件为：95 ℃预变性2 min后进入40个循环扩增阶段，循环条件为：95 ℃变性30 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸45 s;最后于72 ℃延伸5 min。

2.5  统计学方法

所有数据用SPSS 20.0统计软件进行处理，数据用“x±s”表示。对相关数据进行正态及方差齐性检验，如符合正态分布、方差齐性，采用单因素方差分析方法，并采用LSD检验进行组间两两比较;若不符合正态分布，则采用Kruskal-Wallis H检验进行分析。以P<0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1  各组大鼠胃组织病理学情况比较

空白组和空白+中药组大鼠胃组织形态结构无异常，可见结构完整、排列整齐的胃黏膜细胞和腺体;模型组大鼠胃黏膜层变薄，且腺泡减少，腺管不完整，伴有明显炎症细胞浸润，可见IM和IN;维酶素组和中药各剂量组大鼠胃黏膜组织厚度均不同程度增加，腺泡均增加，可见黏膜下层和肌层增厚。维酶素组和中药低剂量组细胞大小较为均一，但细胞排列仍不甚规则;中药中、高剂量组大鼠胃黏膜细胞腺管结构相对完整，细胞核形状、大小较为均匀，排列较为整齐，未见明显炎性细胞浸润。见图 1。

3.2  各组大鼠胃组织SHH、SMO、PTCH mRNA表达水平比较

与空白组比较，模型组SMO、SHH、PTCH mRNA的表达水平均显著降低（P<0.01）。与模型组相比，各治療组SMO、SHH、PTCH mRNA表达水平均有所升高，其中维酶素组、中药中剂量组、中药高剂量组差异具有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。与维酶素组比较，中药各剂量组SHH mRNA表达水平差异无统计学意义（P>0.05）;中药低、中剂量组SMO mRNA表达水平差异无统计学意义（P>0.05），中药高剂量组显著上升（P<0.05）;中药低剂量组PTCH mRNA表达水平下降（P<0.05），但中药中、高剂量组表达水平差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

3.3  各组大鼠胃组织Gli1、Gli2、Gli3 mRNA表达水平比较

与空白组比较，模型组Gli1 mRNA表达水平显著降低（P<0.05），Gli2、Gli3 mRNA表达水平显著升高（P<0.05，P<0.01）。与模型组比较，维酶素组、中药低、中剂量组Gli1 mRNA表达水平有所升高，但差异无统计学意义（P>0.05），中药高剂量组Gli1 mRNA表达水平显著升高（P<0.05），中药低剂量组Gli2 mRNA表达水平无显著变化（P>0.05），维酶素组、中药中、高剂量组Gli2 mRNA表达水平显著降低（P<0.01）;维酶素组和中药各剂量组Gli3 mRNA表达水平均有所降低，但差异无统计学意义（P>0.05）。与维酶素组比较，中药低剂量组Gli2 mRNA表达水平升高（P<0.05）。见表3。

4 讨论

在前期研究中[5，15-17]，课题组以证素辨证为手段，结合福建地域特点，认为PLGC以脾胃气虚为本，以痰、湿、热、瘀为标[5]。多因禀赋不足、饮食不节、情志失调、外邪犯胃等因素，致脾胃亏虚，湿、热邪气胶着于胃脘部，酿而生痰，日久入络，化生瘀毒，从而损伤黏膜组织，致胃黏膜IM及异型增生[16]。如《灵枢·百病始生》曰：“是故虚邪之中人也……留而不去，则传舍于络脉……留而不去，传舍于经……留着于脉，稽留而不去，息而成积。”因此，在PLGC病机演化的过程中，脾胃亏虚为发病基础，湿热邪气贯穿始终，痰瘀为病变关键病理因素。在总结“胃炎1号”[3]“胃炎合剂”[4]疗效基础上进一步优化，拟定“复方胃炎合剂”。方中黄芪、党参同用，健脾养胃、甘温益气;白术健脾燥湿，茯苓健脾渗湿，苓术相配，健脾益气、祛湿之功益著;以上诸药合用，治虚以补后天之本。配法半夏、佩兰、黄连、白豆蔻、陈皮清热祛痰，砂仁、枳壳行气调中、化湿消痞，白芍和营缓急止痛，莪术、地龙逐瘀舒络。诸药并用，共奏健脾清化舒络之功，旨在驱邪扶正、标本兼顾，复脾胃健运之职，以期使萎缩、肠化、异型增生得以渐次逆转。

既往研究[7-8，18]发现，胃黏膜上皮细胞Shh信号转导通路在PLGC的发病过程中扮演了重要的角色。Hedgehog由Nusslein-Volhard和Wiesehaus在研究果蝇的基因突变时发现，1992年成功克隆出该基因[7]。在哺乳动物中Hedgehog家族包括3个同系物：Shh、Indian hedgehog（Ihh）及Desert hedgehog（Dhh）[19]。Shh是Hedgehog家族中研究脊椎动物最好的配体，大部分有关Hedgehog信号通路的研究都是通过Shh实现的。Shh的信号通路受体由PTCH家族受体和SMO两种膜蛋白及下游转录因子Gli构成，转导主要是受相关细胞膜蛋白PTCH和SMO影响，受体PTCH由抑癌基因Patched编码，而癌基因Smoothened则编码着SMO受体[18]。Shh在胞浆内经过一系列反应后形成具有信号转导功能的成熟肽，然后分泌到细胞外，并作为配体与其受体PTCH结合，解除其对中间信号分子SMO的抑制作用，活跃的SMO将Shh信号向细胞内传递，从而激活下游转录因子Gli。脊椎动物Gli家族包括Glil、Gli2及Gli3 3种蛋白，被激活后由细胞浆转位至细胞核内，发挥转录因子作用[19]。

Shh与胃底腺功能的维持关系紧密，但高水平的Shh活化也意味着恶变的风险增加，可能会使细胞增殖不受控制。Berman等[20]发现，胃癌细胞系中存在高水平的Shh通路自发活化。Shh表达上调可引起Shh信号通路中PTCH至Gli1途径的异常激活，并最终导致胃癌的发生。Lee等[21]的研究显示，萎缩、IM和胃腺瘤中Shh都存在过度表达，在Hp感染相关的假幽门腺化生组织中，Shh也出现高表达，并以旁分泌的形式激活Gli在基质中的表达。此外，体内外实验[22]都已显示，Shh通路的拮抗剂环杷明（cyclopamine）特异性结合其中间信号分子SMO后，通过阻断Shh的细胞反应，能够抑制胃癌细胞株的生长，这也从侧面反映出Shh信号通路在胃癌的发生、发展中所起的推进作用。

在本研究中，采用病证结合的造模方法进行证候动物模型的构架，通过胃组织HE染色结果及大鼠一般情况观察可知本方法能较好地构建大鼠PLGC脾虚痰湿热瘀证模型。结合既往相关动物模型构建的研究结果可知，以该方案进行PLGC动物模型构建，实验结果较为稳定[14，23]。在后续药物干预治疗中，维酶素组和中药各剂量组大鼠的胃黏膜病理均较模型组改善，病理结果显示中药中、高剂量组疗效最佳，可知复方胃炎合剂对于PLGC的疗效确切。对Shh信号通路的研究中发现，模型组大鼠存在Shh信号通路的表达异常，信号通路处于抑制状态，与既往的研究[24-25]结果基本一致。加入复方胃炎合剂进行干预后，PLGC脾虚痰湿热瘀证大鼠Shh信号通路关键因子SHH、SMO、PTCH、Gli1 mRNA表达上调，同时Gli2 mRNA表达出现相应下调，表明复方胃炎合剂可通过重新激活抑制状态的Shh信号通路，改善PLGC大鼠的胃黏膜病理改变，抑制PLGC进展。

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