番茄MYB44基因生物信息学及亚细胞定位分析

李 颖，王莹莹，苏 旭，谷建田

（北京农学院植物科学技术学院，北京 102206）

0 引言

番茄(SolanumlycopersicumL.)，俗名西红柿，原产南美洲，是管状花目、茄科、番茄属的一种草本植物，在中国南北方各地均普遍栽培。番茄属于喜温性蔬菜，耐寒性较差，在番茄的不同生长发育阶段，需要相适应的温度，其中幼苗期的最适温度20～25℃，夜温10～15℃[1]。冷害会发生在番茄生长发育的每个阶段，导致番茄生长发育不良、落花落果，使番茄年产量降低，造成严重的经济损失[2]。番茄幼苗期是对冷害比较敏感的时期，为了提高番茄幼苗期的耐寒能力，增加番茄生产效益，有关番茄抗寒基因的功能研究逐渐成为热点。MYB家族是植物中功能最多样化、数量最多的转录因子家族之一。在拟南芥中，已鉴定出超过1600个转录因子基因，约占全基因组的6%[3]，而MYB家族约占拟南芥总转录因子家族的9%[4]。MYB转录因子不仅能对激素以及干旱高温高盐等逆境胁迫做出应答[5-6]，而且广泛参与植物初生和次生代谢反应[7-8]，并对植物的生长发育和形态建成[9-10]具有重要的调控作用。已有研究表明番茄MYB类转录因子在响应低温胁迫方面发挥着重要作用，如：过表达SlMYB41基因使番茄植株对低温更加敏感，而将该基因沉默之后，植株则更能抵御低温胁迫，表明SlMYB41基因是番茄低温抗性的负调控因子[11]。过表达SlMYB113基因的表达量，能够增加花青素的积累，提高了转基因番茄植株的抗寒性，表明SlMYB113基因是番茄响应低温胁迫的正调控因子[12]。另外，超表达SlGAMYBL2基因提高了转基因烟草ABA、甘露醇以及低温胁迫抗性[13]。番茄SlMYBL基因的表达在低温胁迫下受到不同程度的诱导[14]。而SlMYB44基因作为MYB家族的一员，关于该基因在番茄响应低温胁迫中的功能研究甚少。本研究基于转录组测序结果，筛选出差异表达基因SlMYB44开展生物信息学分析，构建表达载体pMDC43-MYB44进行亚细胞定位分析，为后续研究番茄SlMYB44基因低温响应机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试番茄品种为实验室自存俄罗斯普通番茄品种Bolgogragsky，烟草品种为本氏烟草。DH5α大肠杆菌感受态购于北京擎科生物科技有限公司；EHA105农杆菌感受态细胞购于北京华越洋生物科技有限公司；TRzol总RNA提取试剂盒、质粒小提快速试剂盒购于北京博迈德基因技术有限公司。其他试剂盒为实验室常用试剂盒，其他生化试剂为分析纯。试验在北京农学院植物科学技术学院实验室，于2020年8—12月进行。

1.2 主要仪器

GHB-100金属浴，杭州博日科技有限公司生产；85-2数显恒温磁力搅拌器，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司生产；EPS 100型电泳仪，上海天能科技有限公司生产；THZ-C-1台式冷冻恒温振荡器，太仓市实验设备厂生产；MLS-3750自动高压灭菌锅，日本SANYO公司生产；PCR仪，美国Bio-Rad公司生产；ZHWY-103D恒温培养振荡器，上海智诚分析仪器制造有限公司生产；DTY-ZBJ-100制冰机、超净工作台，北京德天佑科技发展有限公司生产；低温生化培养箱，北京博宇宝威试验设备公司生产。

1.3 试验方法

1.3.1SlMYB44基因生物信息学分析 从美国国家生物技术信息中心得到番茄SlMYB44mRNA序列，蛋白氨基酸序列FASTA格式：MAITTNSSKRDMDRVK GPWSPEEDELLQQLVQKHGPRNWS LISKSIPGRSG KSCRLRWCNQLSPQVEHRAFTPEEDETIIRAHARF GNKWATIARLLNGRTDNAIKNHWNSTLKRKCSSLS ADEGNELADQLFENQQPPLKRSVSAGSAMPVTGF HFSPGSPSGSDSDSSLHVTSSSQSQVFKPVARTGGV FPPSIDISSPPVDPPTSLSLSLPGVDLAESSNRSADST QSKNPFQWLLPPMQIPPPPPPPPPPLATTVPFERVSA IQQSLQNPDFGQNSGGEQPDKVFVPFSQELLGVM QEMIKTEVRNYMMGVEQKQQYQRQHYQQQQPQ QFQQQNHQLPSGLGLGLCMQQASDCFRDRAANR MGLSKFD。在NCBI中Conservation Domain程序进行基因保守结构域分析；将氨基酸序列输入ExPASy ProtParam在线软件中，分析SlMYB44的蛋白分子量、脂肪指数、不稳定系数、氨基酸组成等参数，ExPASy ProtScale在线软件分析蛋白所对应的每一个氨基酸的亲疏水性；将该蛋白氨基酸的FASTA文件输入TMHMM Server v.2.0进行SlMYB44跨膜预测分析；利用在线网站Signa1P Server分析SlMYB44信号肽，设置Cut-off值为0.45，其他参数为系统默认参数。C分数为原始卵裂位点得分，CS网络的输出，可以区分信号肽切割位点与其他所有位点。S分数为信号肽分数。SP网络的输出，可以将信号肽中的位置与蛋白质成熟部分中的位置以及没有信号肽的蛋白质区分开。Y得分为合并切割位点得分，即C分数和S分数的斜率的组合，比单独的原始C分数产生更好的切割位点预测。当S＞0.5时，为分泌蛋白且有信号肽，Y的最大值用来判断信号肽的剪切位点；利用SOPMA进行SlMYB44蛋白二级结构预测，参数默认为原始参数；利用Swiss Model软件进行同源建模预测三级结构；启动子分析运用PlantCARE，统计并分析SlMYB44启动子所包含的顺式作用元件。

1.3.2 亚细胞定位

（1）pMDC43-MYB44载体构建

模板扩增：利用Trizol法提取叶片RNA，然后用全式金的TransScript®第一链合成试剂盒将纯化后的总RNA反转录为cDNA，于-20℃冰箱保存。根据NCBI上提供的番茄SlMYB44基因序列(LOC101249225)，利用设计好的引物，以番茄叶片cDNA为模板，对目的片段进行PCR扩增。

PCR产物回收：加入4倍体积的Buffer CP到1.5 mL离心管；剧烈震荡，短暂离心；把吸附柱放在收集管里；把步骤3的混合物转入吸附柱；13800 r/min离心1 min，弃滤液；加入700 μL洗脱液，13800 r/min离心1 min，弃滤液；加入500 μL洗脱液，13800 r/min离心1 min，弃滤液；13800 r/min离心2 min，甩吸附柱上的乙醇；把吸附柱转移到新的1.5 mL离心管，在其中心加入30 μL ddH2O，室温放置1 min；13800 r/min离心2 min，滤液即是回收的DNA；PCR产物连接表达载体。

载体双酶切及连接：配制20 μL（体积）的双酶切连接体系：ddH2O 6 μL；10×FastDigest Green Buffer 2 μL；Vector 10 μL；FastDigest AscI or NcoI 1 μL；FastDigest SacI or PstI 1 μL。配制 10 μL LIC 连接体系 ：5×InFusion Mix 2 μL；target 5 μL；Vector 3 μL；FastDigest AscI or NcoI 1 μL；FastDigest SacI or PstI 1 μL。轻轻摇匀，短暂离心；50℃放置15 min；按照大肠杆菌DH5α说明书步骤将连接产物进行转化，挑取单克隆进行PCR阳性验证。如果跑出条带，则提取质粒进一步测序验证。

（2）农杆菌转化和亚细胞定位：按照热击法，把测序正确的质粒按照EHA105农杆菌感受态细胞说明书步骤进行转化，接种正确克隆于LB液体培养基中摇菌扩繁，用等体积的buffer(10 mmol/LMES，200 μmol/L AS，10 mmol/L MgCl2)悬浮28℃培养至OD600=0.3的农杆菌菌液，并在室温下静置4～6 h活化，然后由下表皮注射到4周大的烟草叶片背面，继续培养4～6天后采集叶片置于激光共聚焦显微镜下，直接观察叶片的荧光情况。

2 结果与分析

2.1 SlMYB44转录因子生物信息学分析

2.1.1 SlMYB44转录因子的保守结构域分析SlMYB44基因全长1551 bp，编码372个氨基酸，它除了含有典型的MYB转录因子家族的DNA结构域，还含有PLN03091、REB1和SANT结构域（图1）。

图1 SlMYB44基因保守结构域分析

2.1.2 SlMYB44转录因子所编码蛋白理化性质分析 SlMYB44蛋白的相对分子质量为41247.25，理论等电点PI为8.25，说明蛋白偏碱性。蛋白质的总分子式为C1797H2819N527O560S15，原子总数为5718。氨基酸数为372个，其中 Arg(R)21 个(5.6%)、Asn(N)17 个(4.6%)、Asp(D)18个(4.8%)、Cys(C)5个(1.3%)、Gln(Q)37个(9.9%)、Glu(E)17 个(4.6%)、Gly(G)23个(6.2%)、His(H)8个(2.2%)、Ile(I)12个(3.2%)、Leu(L)29个(7.8%)、Lys(K)16个(4.3%)、Met(M)10个(2.7%)、Phe(F)15个(4%)、Pro(P)38个(10.2%)、Ser(S)45个(12.1%)、Thr(T)15 个(4%)、Trp(W)6 个(1.6%)、Tyr(Y)15个(4%)、Val(V)18个(4.8%)。带负电荷的残基总数（Asp和Glu）为35个，带正电荷的残基总数（Arg和Lys）为37个。SlMYB44蛋白的不稳定指数为63.96，因此将该蛋白质归类为不稳定蛋白。脂肪指数为62.12，总平均亲水性为-0.732。预测该蛋白的半衰期为：在哺乳动物网织红细胞中30 h，在酵母中大于20 h，在大肠杆菌中大于10 h。在该蛋白亲疏水性分析中，最大疏水性值为1.533，最大亲水性值为-3.411。如图2所示，在SlMYB44蛋白中亲水性的氨基酸明显更多，说明该蛋白属于亲水性蛋白。

图2 SlMYB44蛋白的理化性质分析

2.1.3 SlMYB44转录因子所编码蛋白信号肽分析 切割位点C的最大值为0.132，位于29位氨基酸；信号肽分数S的最大值为0.261，位于8位氨基酸；合并切割位点Y最大值为0.147，位于29位氨基酸。S平均值0.171，其预测的剪切点在1～28位氨基酸。S平均值远远低于0.5，说明SlMYB44蛋白为非分泌蛋白，没有潜在的信号肽位点（图3）。

图3 SlMYB44蛋白信号肽预测

2.1.4 SlMYB44转录因子所编码蛋白跨膜域分析 SlMYB44转录因子所编码的372个蛋白氨基酸均不在跨膜区，说明SlMYB44蛋白不含跨膜结构，不属于跨膜蛋白（图4）。

图4 SlMYB44蛋白跨膜域预测

2.1.5 SlMYB44转录因子所编码蛋白二级结构预测分析 SlMYB44蛋白中有233个氨基酸残基组成不规则卷曲，含量高达62.63%，其次为α-螺旋，占25.54%，延伸链占8.06%，最少的是β-折叠，仅占3.76%（图5）。

图5 SlMYB44蛋白二级结构预测

2.1.6 SlMYB44转录因子所编码蛋白三级结构预测分析 为了解SlMYB44蛋白的三维结构，利用Swiss Model软件对其进行同源建模，获得三维效果图（图6）。

图6 SlMYB44蛋白三级结构预测

2.1.7 SlMYB44转录因子启动子顺式作用元件分析 利用软件Plant CARE对SlMYB44基因启动子序列上的顺式作用元件进行预测分析，并对结果进行分类整理，如表1所示。表明在SlMYB44基因顺式作用元件中，大部分与逆境胁迫、激素响应等元件相关。

表1 SlMYB44基因启动子顺式作用元件分析

2.2 SlMYB44转录因子亚细胞定位

2.2.1 pMDC43-MYB44载体构建

（1）引物设计及扩增

根据NCBI上提供的番茄SlMYB44基因序列设计特异性引物（表2），选取SlMYB44基因扩增编码区cDNA序列片段，对其进行扩增，得到了全长1119 bp的目的片段（图7）。

表2 引物设计列表

图7 KOD-FX扩增

（2）pMDC43-MYB44的菌落PCR鉴定

PCR产物回收后，根据无缝连接试剂盒，进行连接转化。分别挑取4～8个克隆PCR鉴定，PCR扩增所用引物为载体上的测序引物(43F/43R)（图8）。

图8 载体pMDC43-MYB44菌液PCR结果

2.2.2 亚细胞定位及荧光观察 网站ProtComp 9.0预测分析结果表明SlMYB44蛋白定位在细胞核内。本实验中，根据氨基酸表达分析和荧光形态白场位置判断，自发光的信号来自于叶绿体，从图中可以看出，绿色和红色没有重合，说明SlMYB44蛋白没有在叶绿体中表达。SlMYB44蛋白的荧光信号出现在细胞核上，阴性对照的空载荧光信号分布在细胞核以及细胞膜上。说明SlMYB44蛋白大部分表达于细胞核，与预测结果一致（图9）。

图9 亚细胞定位图

3 讨论与结论

R2R3-MYB蛋白是植物特有的最丰富的物种，在植物的基因组中大约有100多个R2R3-MYB成员，积极参与植物生长发育、次生代谢调控、生物和非生物胁迫应答[15]。MYB44是典型的R2R3-MYB转录因子，通过基因枪介导法将带有AtMYB44基因的表达质粒导入小麦幼胚诱导的愈伤组织中，证明拟南芥AtMYB44基因对小麦抗病能力存在影响[16]。将拟南芥AtMYB44基因转入水稻，表明该基因过量表达明显提高了水稻对低温胁迫的耐受性[17]。马铃薯StMYB44、StMYB44b基因能够在植物响应蔗糖中起重要的调控作用[18]。茄子SmMYB44转录因子通过激活亚精胺合酶的表达来增强抗病能力[19]。拟南芥AtMYB44通过依赖于SA防卫信号通路正调控其抗病性[20]。马铃薯StMYB44通过抑制磷转移相关基因StPHO1表达负调控磷的转运[21]，说明MYB44基因在响应逆境胁迫中发挥着重要的作用。番茄SlMYB44基因顺式作用元件分析也表明大部分与逆境胁迫、激素响应等元件相关，亚细胞定位结果表明SlMYB44蛋白大部分表达于细胞核。该结果对于探索SlMYB44在番茄抗寒过程中发挥的作用，丰富MYB基因家族成员的研究提供生物信息学参考。为了更深入地探寻该基因在番茄耐冷胁迫中发挥的作用，下一步可构建过表达载体并对番茄外殖体进行遗传转化，对过表达阳性植株进行低温处理并测定相关生理生化指标。同时也可以根据亚细胞定位结果进行蛋白互作位置研究，进一步探究番茄SlMYB44基因信号转导、基因调控、蛋白互作和分子调控机制。