烷基酚聚氧乙烯醚及相关代谢物检测方法研究进展

虞冰，林琴，张春荣，吴园园，郭钤，汤涛*

(1.金华市农产品质量综合监督检测中心，浙江 金华 321017； 2.浙江省农业科学院 农产品质量标准研究所，浙江 杭州 310021)

环境内分泌干扰物(EDCs)是一类干扰生物体内分泌的外源性物质，此类物质在环境中的浓度较低，急性毒性较弱，但能引起生物体的生殖障碍、代谢紊乱、发育异常及某些癌症(如乳腺癌、睾丸癌、前列腺癌等)的发生[1-2]。1996年12月，欧盟首次讨论了内分泌干扰物对人体和其他生物体的影响，并将烷基酚类(APs)列为其中一类内分泌干扰物，APs因具有明显的环境雌激素效应而引起广泛关注和研究[3]。

烷基酚聚氧乙烯醚(APEOs)属于非离子型表面活性剂，具备良好的润湿性、分散性、洗涤性、乳化性、增溶和渗透作用，可广泛应用于日用化工行业，如制备洗涤剂、造纸、纺织印染、冶金、制药、农药、印刷、合成树脂、合成橡胶、塑料等行业[4]。APEOs包括约80%的壬基酚聚氧乙烯醚(NPEOs)、约15%的辛基酚聚氧乙烯醚(OPEOs)、约1%十二烷基酚聚氧乙烯醚(DPEO)和二壬基酚聚氧乙烯醚(DNPEO)[5-6]。

毒性、生物降解性、环境激素和在生产过程中产生的有害副产物是APEOs产生危害的主要方面[7]。APEOs具有环境激素效应，已被国际列为禁用的70种环境激素之一。APEOs的降解产物APEO1-2和APs具有食物链的生物累积效应，APEO1-2和APs可在低级生物中聚集，再通过食物链在更高一级的生物体体内富集，当APEOs及代谢物在人体内累积达到一定量时容易致病和中毒，APEOs及其代谢物对人体主要的危害是与雌激素受体结合，从而影响人体正常激素分泌，导致生殖器官异常、精子数量减少等[8-9]。APEOs单体的溶解性随着APEOs链长逐渐的缩短而减弱，毒性则是随着链长的缩短而增强。相较于APEOs，APs对水生物的毒性更高，鱼类和海藻对NPEO1-2的急性毒性范围为4 600～14 000 μg·L-1，NP的急性毒性范围则为17～3 000 μg·L-1，依据美国环保署(EPA)的制定标准，NPEO1-2为中等毒性，NP为高毒性[9]。因此，这些物质对环境和人类健康造成很大的威胁。APEOs在自然环境中普遍存在且浓度较低，环境中APEOs含量的测定对检测方法的灵敏度、准确性和稳定性要求较高，建立并验证可靠的检测方法尤为重要。

1 烷基酚聚氧乙烯醚及烷基酚的检测技术进展

检测不同的基质中的APEOs及其代谢产物，所选的仪器不同，前处理方法也不同。如表1所示，一般检测固态基质中的APEOs和APs，通常采用甲醇作为萃取剂，超声萃取或固相萃取，接着进行氮吹，定容后待检测。而对于液态基质，通常采用乙腈、甲醇或正己烷作为萃取剂，液-液萃取，接着过柱后过0.22 μm膜，待检测。因此，在今后的研究中，在检测APEOs和APs选取前处理方法时，要考虑基质对检测的影响。

表1 检测技术的前处理方法

1.1 烷基酚聚氧乙烯醚及烷基酚样品的前处理方法

前处理的目的是将目标化合物从基质中分离出来，降低基质干扰，使其成可检测、可分析状态。检测APEOs和APs的前处理方法的步骤一般为提取、净化和浓缩。而前处理提取方式有索氏提取法、液-液萃取法、微波萃取法、超声萃取法、固相萃取和QuEChERS法等。

1.1.1 索氏提取

索氏提取法是利用相似相溶和虹吸原理，用溶剂将固体长期浸润，将待提取的物质浸出来。常用的提取溶剂有乙腈、二氯甲烷、甲醇、乙酸乙酯、石油醚和正己烷等。陈武炯[11]利用150 mL甲醇经索氏提取器提取5 h，检测纺织品中的APs和APEOs残留，该方法回收率为80%～95%，相对标准偏差(RSD)为1.3%～4.6%(n=5)。GB/T 23322—2009[21]规定了纺织品中APEOs检测的前处理方法以甲醇为提取溶剂，索氏提取3 h，该方法回收率为90%～110%，RSD<10%，该标准已于2018年被GB/T 23322—2018[22]替换。索氏提取法提取效率虽高，但所需溶剂消耗量大、提取的时间长，操作也较为复杂。

1.1.2 液-液萃取

液-液萃取原理是依据目标化合物在不同溶剂中的溶解度不同，进而将其从另一种溶剂中分离出来。常用的萃取溶剂有乙酸乙酯、甲醇、氯仿、二氯甲烷和乙腈等。液-液萃取主要应用于提取液态基质中APEOs及其代谢物。Li等[14]用甲醇提取饮料中的NP和OP，方法回收率为82%～94%，RSD<3.2%。蔡素婷等[20]用50%硫酸溶液调节1 L水样的pH至小于2后，用60 mL的二氯甲烷反复提取3次，浓缩后用正丙酮定容、N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺和三甲基氯硅烷(BSTFA+TMCS，体积比99∶1)衍生0.5 h，经GC/MS分析后，4-t-OP、NP、4-t-OPEO1-2和NPEO1-24种化合物的回收率85%～110%，RSD为5.1%～8.8%。孙彦[19]也利用二氯甲烷做萃取溶剂提取水中的p-t-OP、AP和APEO1-2，回收率为84%～103%，RSD为5.8%～13.0%。液-液萃取法优点是回收率高、重现性好，缺点是提取溶剂量较大、萃取时容易形成乳液，需进一步分离，且该方法适合提取简单的基质中短链的APEOs和代谢物，当基质体系较为复杂时，提取效果不理想。

1.1.3 微波萃取

微波萃取主要是利用微波的热效应，加速化合物的运动，使其被有效提取。王成云等[16]用甲醇作萃取剂微波萃取30 min，反复萃取2次纺织品中的NP、OP、NPEO3-16和OPEO3-16，方法回收率达93%～104%，RSD<5%，方法检测限为0.01～0.025 mg·L-1。微波萃取法的优点是设备简单、萃取效率高、重现性好、节省时间和试剂等优点。

1.1.4 超声提取

超声提取的原理是利用超声波的空化效应和次级作用，促进化合物和基质的分离和促进化合物与提取溶剂的融合。黄芳等[10]用甲醇和水的混合溶液提取纺织品中的APEOs，回收率为91%～98%，RSD<5%。蒲爱军等[23]以甲醇为溶剂超声波萃取纺织染整助剂产品中残留的NP、OP、NPEO2-17和OPEO2-17，回收率为98%～102%，RSD均<5%。左莹等[24]用乙腈做萃取剂，分别超声5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70 min后，测定纸中APEOs的含量。结果表明：超声萃取时长超过35 min后，提取效率相近，最终选择用乙腈超声萃取35 min，该方法回收率为51%～117%，其中OPEO2、NPEO2-4、NPEO14-20回收率不足70%，RSD为2%～12%。超声萃取法操作简单，但仅对APs和特定聚合度的APEOs提取效率较高。

1.1.5 固相萃取

固相萃取法通过选择性吸附目标组分和选择合适的洗脱液，净化并分离出目标组分。林琴[25]用甲醇-水溶液提取茶鲜叶、干茶和茶汤中的APEOs，经HLB固相萃取柱富集和净化、再用含5%二氯甲烷甲醇溶液淋洗，3种基质中的回收率分别为32%～111%、61%～112%和72%～117%，RSD<20%。王金成等[18]将海水经C18固相萃取柱富集净化后，用20%甲醇水淋洗，此方法NP的回收率为59.6%～64.4%，OP和APEOs的回收率为84.4%～104.4%，RSD为1.0%～13.5%。水基质中的NP和OP还可以用二氯甲烷/正己烷(4∶1，V/V)或MTBE/甲醇(1∶1，V/V)混合萃取后，经HLB固相萃取柱富集后分析检测[26-27]。固相萃取法可富集净化复杂固态基质和液态基质中的APs和APEOs，可检测范围较广，此方法的缺点是萃取的容量低且容易阻塞固相萃取柱。

1.1.6 QuEChERS法

QuEChERS(Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe)是近年来国际上比较流行的一种农产品检测快速前处理技术。该方法的原理是利用吸附剂填料吸附基质中的杂质，达到净化的目的。Chen等[28]用乙腈提取蜂蜜、花粉和蜂蜡中的APEO3-13，1 mL提取液经150 mg MgSO4，150 mg PSA和50 mg C18净化后，回收率为75%～111%，RSD<9%。Jiang等[29]用QuEChERS法净化卷心菜，生菜和菠菜样品中APEO2-20，该方法的回收率为72.8%～122.6%，RSD≤18.3%。QuEChERS法操作简单、所需有机溶剂量少，可有效节约实验成本，且此方法回收率高可检测固态基质中不同聚合度的APEOs。

综上所述，上述几种前处理提取方法中，索氏提取法花费时间较长、溶剂需求量较大且操作复杂；液-液萃取法溶剂需求量也较大，且仅适用于液态基质中目标化合物的提取；微波萃取操作简单、提取效率较高；超声萃取适合提取APs和特定聚合度的APEOs；固相萃取法虽适用于提取多种复杂基质中的APs和APEOs，但固相萃取柱也有容量低、易阻塞吸附剂的缺点；QuEChERS法回收率较高，可检测较高聚合度的APEOs，适用于提取复杂基质中的APEOs。

1.2 烷基酚聚氧乙烯醚及烷基酚的仪器分析方法

APEOs及APs的仪器分析方法主要是色谱法和质谱法。其中普遍采用HPLC法、GC法、LC/MS法和GC/MS法(表2和表3)来分析测定各种基质中的APEOs及其代谢产物的含量。

表3 固态基质的分析方法

表2 液态基质的分析方法

1.2.1 HPLC法

HPLC是一种具有广泛适用领域的分离分析方法，由于其具有广泛的选择性、高体积流速、耗样量较小、高灵敏度、良好的分离效能和不破坏原有样品等优点，而被广泛应用于各个学科领域。

黄芳等[10]采用高效液相色谱/核磁共振光谱法来测定纺织品及纺织助剂中APEOs，用外标定量法，首先对流动相和检测波长进行选择，接着用双体系色谱进行定性，最后再用核磁共振光谱进行验证。实验结果表明：该方法可用于测定纺织品及纺织助剂中APEOs类化合物，并且能达到足够的准确度和检测下限，方法可靠。

陈武炯[11]采用高效液相色谱/二极管阵列检测器分别对纺织品中的APs和APEOs进行检测。对波长和流动相条件进行筛选，最终确定最佳的仪器条件，该方法中OP、NP及OPEOs的线性范围为5～100 μg·mL-1，NPEO的线性范围为10～200 μg·mL-1，R2为0.998 3～0.999 8，检测限为0.1～2 μg·mL-1。刘显奎等[26]采用高效液相色谱/二极管阵列检测器对皮革中的APEOs进行检测，对波长、流动相、萃取方式、萃取时间和萃取温度进行了条件筛选，最终确定运用甲醇超声60 min萃取结果最佳，方法回收率为86%～110%，RSD为2.9%～3.2%，OPEOs和NPEOs检出限为3.4 mg·kg-1和3.7 mg·kg-1。高效液相色谱/二极管阵列检测器可对APEOs进行定量分析。

Cheng等[13]选取台湾当地大型超市中的集中洗涤剂和洗衣粉，先溶于甲醇后过膜，采用HPLC/FLD检测其中NPEOs的含量，得到41%的洗涤剂中均含有不同浓度的NPEOs，后来又用LC/MSI/MS进行验证其含量，得出该方法可以检测NPEOs的含量。Li等[14]同样采用HPLC/FLD方法检测河水中的NP和OP的含量，前处理方法中添加了BCEC-Cl进行衍生化，从而增加了分析物的疏水性、灵敏性，减小了杂质干扰，该方法回收率为82%～92%，RSD为6.4%～8.8%，LOD为0.03 μg·L-1，LOQ为0.1 μg·L-1。Lou等[15]采用新型固相萃取柱进行萃取、用HPLC/FLD分析检测地表水中的NP，线性范围为10～200 μg·L-1，相关系数为0.999 5，LOD和LOQ分别为0.44 μg·L-1和1.47 μg·L-1。该方法提供了一种新的萃取方式，为今后的研究建立了基础。

APEOs的分子量比较大，挥发性较差，比较适合用高效液相色谱进行测定。然而用液相色谱检测APEOs存在一些不足，即反相高效液相色谱不能区分不同聚合度的APEOs，而正相高效液相色谱不能区分同一聚合度的不同结构，因此，目前很少使用单一的高效液相色谱来检测APEOs及其代谢产物的含量，一般采取与质谱或者其他检测器联用的方法来进行检测。

1.2.2 LC/MS法

LC/MS法具有灵敏度高、选择性较好等优点，用来分析测定APEOs，可对不同聚合度的APEOs定性和定量[30-38]。

Salgueiro-González等[39]利用LC/MS法检测河水、饮用水和海水中的NP和OP，并且对MASE萃取方式的萃取参数(包含萃取剂、萃取温度、萃取时间)进行优化，得到在正己烷、温度为40 ℃、时间60 min时萃取效果最佳，接着比较了不同基质对APs回收率检测的影响，最后对该方法进行了验证。该方法回收率和相对标准偏差均符合要求，从而得到应用于水中APs的前处理和仪器分析的最佳方法。

蒲爱军等[23]以甲醇为溶剂经超声波萃取、采用高效液相色谱/质谱法来检测纺织染整助剂产品中残留的APEOs，并对色谱分析条件(包含流动相、色谱柱、柱温以及监测离子)和前处理条件(主要是萃取剂)进行优化，得出用甲醇萃取、流动相为甲醇/水=85/15、柱温为40 ℃时，分离效果较好。

Chen等[28]用QuEChERS法结合UPLC/MS分析检测了蜂蜜、花粉和蜂蜡中的OPEO3-13和NPEO3-13，NPEOs和OPEOs的平均检测限分别为0.56 μg·kg-1和0.44 μg·kg-1，实际样品中检出NPEOs浓度为26～10 239 μg·kg-1。林琴[25]利用SPE法结合LC/MS分析茶叶基质中的APEO3-20，该方法筛查出市售茶叶中的OPEO3-20和NPEO3-20的含量范围分别为0.03～12.9 μg·kg-1和0.3～215.9 μg·kg-1，而市售茶饮料中APEOs的含量则均低于LOQ。

另外王成云等[16]、王爱霞等[17]和王金成等[18]也通过LC/MS分别来检测纺织品、内墙涂料和海水中的APEOs。LC/MS法可有效应用于定性定量分析测定多种基质中的APEOs及其代谢产物，检测方法简便、快速、灵敏度高、结果稳定。

1.2.3 GC法

20世纪30年代，舒夫坦和尤肯发展了气固色谱法。接着詹姆斯和马丁提出气液色谱法，而现在气相色谱法有时主要指气液色谱法。气相色谱法主要应用于环境保护、石油工业、药物学、临床化学和食品工业等。张洛红等[12,40-43]和冯琳等[44]都建立毛细管内固相萃取/气相色谱检测方法，用优化后的毛细管固相萃取柱对APs进行萃取后进行气相色谱检测。该方法能够对ppb级别残留量的检测。气相色谱法具有检测灵敏度高、分离效率高、选择性和样品用量少等优点。而缺点是在定性、定量分析时，必须用已知物或已知数据比对和校正，因此，在同时检测多种APEOs时并不适用。

1.2.4 GC/MS法

GC/MS法的研究开始于60年代，后来随着80年代新的质谱技术出现，越来越广泛地被应用。GC/MS是利用气相色谱的分离能力和质谱的鉴定能力达到对目标分子定性定量的目的。GC/MS法适合分析测定分子量较小、挥发性较好的APs与短链APEOs，不适合聚合度较高的难挥发的APEOs。

蔡素婷等[20]和Li等[30]均采用GC/MS法分别对水和尿液中的短链APEOs进行检测。运用二氯甲烷、甲醇作为萃取剂，用液-液萃取、固相萃取来检测。然而尿液中和饮用水中的NP含量明显差异很大，Li等[30,45-47]通过儿童和成人的对比，并且研究运用塑料杯和陶瓷杯来饮用水情况下尿液中NP的含量，从而对儿童健康和日常饮食提出了宝贵建议。相关研究为GC/MS对短链APEOs检测提供了范例，也为今后进一步的研究奠定了基础。

GC/MS法可以同时定性、定量检测，优点是分辨率较高、分离效率高、选择性比较好和检测速度快[48]。但运用GC/MS法检测APEOs时，由于其挥发性较差，用气相色谱质谱测定之前必须进行衍生化反应，衍生化时间甚至长达12 h[19]，前处理过程耗时长、操作较繁琐，并且GC/MS分析对象局限于APs和APEO1-2，因此，目前该方法并不能广泛运用。

2 小结与展望

目前色谱类分析方法已经得到了广泛应用，是检测APEOs及其代谢产物的重要手段。以往的研究中主要是针对纺织品和水中的APEOs和APs的检测，并且不同方法之间的差异较大，单一的色谱法往往检测限比较高，并不适合浓度较低的基质中的痕量检测，而且不能准确地定量检测。因此，色谱与其他检测器联用是分析检测APEOs和APs的常规方法，其中使用较多的是色谱质谱联用法。相对于单一的色谱法，色谱质谱联用方法具备简便、快速、灵敏度高、定性定量效果好等优点。但其缺点是分析和检测受场地限制，无法在现场进行快速检测。

因此，优化和改进不同基质中APEOs和APs的分析检测方法是势在必行的。首先，需要优化前处理步骤和仪器检测条件，使得色谱类分析方法操作更加简便。简化操作方法，才能节约时间和成本。其次，开发其他基质如农药、植物基质和动物基质等的分析检测方法。目的是简化现有方法的同时，拓宽可检测范围。最后，还可以开发一些新的方法如生物学方法，快速检测试剂盒等来检测APEOs和APs，开发便携的、能超快速检测的仪器和其他类新的方法也是今后的发展趋势之一。