浙江天目山蝉花虫草的分离及基质栽培

饶雨欣，郎茂荣，江宏，童小青，王勇军*

(1.浙江农林大学 林业与生物技术学院，浙江 杭州 311300； 2.杭州临安华茵生物技术有限公司，浙江 杭州 311300)

蝉花虫草(Cordycepscicadae)又名蝉茸、虫花、蝉虫草、蝉茸菌，为蝉棒束孢菌真菌寄生于蝉若虫后形成的菌虫复合体，是我国一种传统的药食两用真菌。宋代唐慎微《经史证类备急本草》记载“味甘，寒，无毒；主小儿天吊，惊痫螈，夜啼心悸；所在皆有，七月采；生苦竹林者良，花出土上”。在现代医学中，蝉花含有糖原、甘露醇、多种生物碱、蛋白质、多种氨基酸及多种微量元素等化学成分，具有免疫调节、代谢调节、解热镇痛、镇静催眠、改善肾功能、降血糖、抗肿瘤等药理作用[1-2]。蝉花虫草为世界性广布种，在我国分布于秦岭淮河以南，主要生长于热带和亚热带的阔叶林、针阔叶混交林及竹林等生境中[3]。蝉花虫草的寄主主要包括山蝉Cicadaeflammata、蟪姑Platypleurakaempferi、黑蚱Crytotympanapustulata、竹蝉Platylomiapieli等蝉科昆虫[4]。笔者在浙江省杭州市天目山区进行资源调查时发现，蝉花虫草广泛分布于竹林中，长期被当地竹农采收并作为药用真菌。本研究从天目山竹林土壤感染竹蝉中分离获得1株蝉花虫草菌株TM06，并进行了人工栽培探索，为蝉花虫草资源开发提供了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 蝉花虫草菌株

蝉花虫草分离物TM06采集于浙江省杭州市临安区天目山竹林(119°31′1″E 30°20′7″N)土壤感染的竹蝉。

1.1.2 培养基

PDA培养基。马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂18 g，水1 000 mL，pH 7.0，121 ℃灭菌30 min。

M1液体培养基。马铃薯200 g，葡萄糖30 g，K2HPO40.5 g，MgSO41 g，柠檬酸铵1 g，蛋白胨3 g，复合维生素B 150 mg，水1 000 mL，121 ℃灭菌30 min。

小麦基质培养基。每个玻璃培养瓶(5 cm×5 cm×10 cm)分别装入约25 g小麦和20 mL的M1液体培养基，添加不同量的蝉蛹粉，混匀后121 ℃灭菌30 min。

市售蝉蛹粉，过0.15 mm筛后备用。

1.2 方法

1.2.1 真菌的分离

用小铲子取露出蝉花的虫体，拭去黏附土壤，置于取样袋中，放入冰盒带回实验室进行分离纯化。用剪刀剪取蝉花组织，表面用75%酒精消毒10 s后，用无菌水进行冲洗2遍后，用镊子撕开表皮，取长、宽为1 mm大小的组织块，接种于PDA培养皿中，避光条件下24 ℃培养。待菌丝长出，用挑针挑取少量菌丝置于新鲜PDA培养皿中进行培养，观察菌丝形态，获得纯培养物。

1.2.2 ITS-PCR及序列测定

采用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒(生工®，上海)进行真菌菌丝总DNA的提取，采用真菌核糖体基因间隔区(ITS)通用引物ITS1(5′TCCGTAGGTGAACCTGCGG3′)和ITS4(5′TCC TCCGCTTATTGATATGC3′)对基因组DNA进行PCR扩增。扩增体系为94 ℃，5 min；94 ℃，45 s，55 ℃，45 s，72 ℃，1 min，30个循环；72 ℃，8 min。将扩增得到的DNA片段送至生工生物工程(上海)股份有限公司双向测序，采用DNAMAN软件进行拼接。序列采用MEGA 7.0软件进行系统发育树构建，采用Maximum Likelihood analysis进行分析，自展数据(bootstrap)为1 000次[5]。

1.2.3 蝉花虫草的人工栽培

取在PDA培养基生长的蝉花虫草菌丝块，置于M1液体培养基中，160 r·min-1，22 ℃黑暗条件进行震荡培养，培养6 d，至菌丝小球长出，用小型搅拌器混匀后，吸取1 mL菌液添加至含有不同浓度蝉蛹粉的小麦基质培养基，黑暗条件22 ℃下进行培养，待菌丝长满培养瓶，进行光照诱导(黑暗12 h/光照12 h)，待生长成熟后，取子座组织进行称重。

1.3 数据统计与分析

采用SPSS v.19数据系统进行统计分析，采用Duncan’s新复极差法进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 蝉花虫草TM06的分离培养及人工基质栽培

采集的蝉花是由虫体和孢梗束两部分组成的生物体，寄生的蝉若虫较大，表面披覆着灰白或灰黄色的茸毛状菌被。蝉花子座一般单生、2个或多个，不分支，呈棒状、褐色；蝉花的孢梗束由蝉的前端长出，单生或丛生，上部反复分枝，分枝顶端膨大(图1中A)。蝉花菌丝在PDA培养基上菌丝白色，稀松，底部产红色色素，易形成孢子(图1中B)。

蝉花虫草TM06菌株在小麦基质培养基上培养将近10 d后，白色菌丝布满整个基质；15 d后，子座形成，有子实体长出，菌体颜色加深，呈淡黄色；40 d后，子实体生长茂密，高5～7 cm，直径1～3 mm，顶部有大量珊瑚状分支，子实体成熟(图1中C)。

图1 蝉花虫草TM06的分离(A和B)及基质栽培(C)

2.2 蝉花虫草TM06的ITS遗传系统分析

利用引物ITS1和ITS4进行PCR 扩增，获得蝉花虫草TM06的ITS部分序列，NCBI登录号为MW040504。利用MEGA 7.0软件构建系统发育树，分析结果显示，TM06与蝉花虫草QCS2007071701菌株和JGS2014061604菌株亲缘关系最近，构成1个分支(图2)。

图2 基于ITS序列构建的系统发育树

2.3 添加不同浓度的蝉蛹粉对TM06子实体产量的影响

在小麦基质培养基中分别添加2%、5%、10%和15%(重量百分比)的蝉蛹粉，测定蝉蛹粉对蝉花虫草TM06子实体生长的影响。由表1可知，小麦基质培养基中添加蝉蛹粉后，子实体干重明显提高。其中，添加5%的蝉蛹粉效果最佳，子实体每瓶平均干重达到11.61 g。同时发现，蝉蛹粉添加超过10%时，反而降低了子实体的产量。

表1 不同浓度蝉蛹粉对蝉花虫草TM06子实体产量的影响

3 小结与讨论

虫草属真菌的资源挖掘和人工栽培，是当前研究和开发的热点，对功能食品开发和野生资源保护均具有重要意义[6]。本研究从浙江天目山竹林感染的蝉若虫上分离获得1株蝉花虫草TM06，采用小麦基质培养基完成了该菌株的人工栽培，并测定了蝉蛹粉对TM06菌株人工栽培下的增效作用。研究结果明确了浙江天目山竹林蝉花的菌种特性，并建立了人工栽培技术。蝉花虫草的药理成分及药效功能已取得重要进展[1,7-8]，但不同来源、不同栽培方式的虫草，在药理成分及功效上可能存在差异[9]。下一步将围绕人工栽培的蝉花虫草的药理学成分及功效开展研究。