菌剂添加对人工林土壤呼吸和有机质含量及细菌群落影响

钱壮壮，朱孔鑫，王会利，覃其云，邓小军，曹继钊，庄舜尧★

（1.中国科学院南京土壤研究所，江苏 南京210008；2.广西林业科学研究院，广西 南宁530002）

人类的化石燃料使用、工业生产以及毁林开荒等活动导致大量的CO2向大气排放, 使得大气CO2浓度显著增加[1-2]。由于大气CO2浓度上升引起的全球变暖已经成为一个重大的环境挑战，“温室效应”可能对世界环境和经济产生深远的影响[3]。土壤是陆地生态系统最大的碳库，土壤有机质对维持土壤质量和生态系统功能起着重要作用[4-5]。人工林栽植可以在较短时间内吸收大气中大量的CO2，把碳固定在植物和土壤中，因此，被广泛认为是缓解全球气候变化的有效方法[6]。

桉树（Eucalyptusspp. Smith）原产澳洲，由于其生长速度快，抗性强，适应性强，经济价值高等特点在中国南方尤其是广西壮族自治区广泛引种，目前在广西桉树人工林面积已有171.29 万hm2[7-8]。广西地处中国西南方，属于亚热带季风气候和热带季风气候，水热条件好，是中国的人工林种植大省。目前，广西全区拥有林业用地约1 600 万hm2，占全国林地面积的10%，林地资源相当丰富[9]。广西的重要人工林树种还包括松树（Pinus spp.） 和杉 木（Cunninghamia lanceolata），分别占全区树种结构的11.50%和17.66%[10]。但是，在人工林的经营过程中，由于人工林经营以纯林为主，且轮伐期较短，林木被砍伐后，大量的生物量和养分被移出，使得养分无法归还到土壤，随着经营时间的延长，土壤地力衰退，土壤生产能力急剧下降[11-12]。

森林凋落物是森林植物在其生长发育过程中新陈代谢的产物。凋落物作为土壤有机质输入的主要来源，是土壤微生物进行生命活动的物质基础，而且对土壤温度、湿度也会产生影响，进而影响到土壤呼吸作用[13-14]。目前已有很多关于广西人工林地力维持的研究，但是主要集中在地力退化[15]，生态评估地力评价[16-17]，合理施肥[18-20]等方面，对于菌剂腐解凋落物和林地土壤微生物的研究还比较少。菌剂具有促进凋落物及土壤养分循环，增加土壤肥力的作用[21]。菌肥主要施用在水稻、小麦[22-23]及蔬菜[24-25]等农作物土壤中，但是，目前缺乏菌剂对人工林土壤地力提升方面的研究。因此，本研究目的是通过比较不同市售菌剂对3 种林地凋落物分解及土壤有机质含量的影响，明确菌剂对土壤有机质提升的作用及机制，从而为广西人工林地力提升和生态修复提供支持。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

研究区位于广西壮族自治区崇左市扶绥县东门林场，地理位置22°19′47″ N，107°50′31″ E，属亚热带湿润季风气候，年平均气温21.7 ℃，年平均降雨量约1 300 mm。

1.2 试验设计

土壤样品来自于广西壮族自治区东门林场5年生桉树林（Eucalyptus robusta），10年生杉木林（C.lanceolata）及15年生马尾松林（P. massoniana）。每种人工林试验地面积为50 m×50 m，从每个试验样地每种森林类型采用5 点交叉采样法采集0~10 cm 深度土壤样品，取样前，要将枯枝落叶清除，取样点的土样由5 个重复混合而成。土样去除根系和石头后，在室温下自然风干，过2 mm 筛后备用。在采集土壤的过程中，同时随机采集地面上的枯叶，取回实验室烘干研磨过2 mm 筛备用。

各取20 g 过2 mm 筛的桉树、杉木及马尾松林下风干土壤均匀混合为60 g 土（土壤初始有机质含量为51.11·g kg-1），平铺于500 mL 玻璃锥形瓶中，取粉碎后的桉树叶，杉木叶和马尾松叶0.2 g 分别与0.1 g 市售菌剂（韦美微生物菌剂，潍坊市信得生物科技有限公司，主要成分为棘孢木霉菌、枯草芽孢杆菌等；益加益发酵剂，益加益生物科技有限公司，主要成分为芽孢杆菌、酵母菌、乳酸菌、固氮菌等；贝佳有机肥发酵剂，山东贝佳生物科技有限公司，主要成分为芽孢杆菌、放线菌、酵母菌、木霉菌等）均匀混合洒在土壤表面，湿润土壤水分至田间持水量（共计9 个处理，记为松益（SEb）、杉益（SHEb）、桉益（AEb）、松韦（SWb）、杉韦（SHWb）、桉韦（AWb）、松贝（SBb）、杉贝（SHBb）、桉贝（ABb）,同时做未加菌剂只加3 种凋落物的空白组记为松CK，杉CK，桉CK）。将一个装有50 mL 0.1 mol·L-1KOH 溶液的小瓶子系在土壤表面上方，以吸收释放的CO2。每个处理3 个重复，共计36 个锥形瓶封口放置在一个有密封盖和无光的培养箱中25 ℃培养。每周测定释放的CO2并更换KOH 溶液及补充土壤水分。培养期为2 个月。用0.1 mol·L-1HCl 滴定KOH 溶液中吸收的CO2并计算呼吸速率。培养结束后仔细去除上层凋落物及菌剂后，取出锥形瓶中的土壤，一部分风干过0.25 mm 筛测定土壤有机质含量，一部分新鲜土壤放入－80 ℃冰箱保存，用于微生物测定。

1.3 土壤样品分析方法

1.3.1 有机质测定

土壤有机质采用浓硫酸重铬酸钾外加热法测定[26]。

1.3.2 DNA 提取和PCR 扩增

1.3.3 库的构建和排序

1.4 数据分析

1.4.1 测序数据的处理

将原始的fastq 文件解复用，并使用QIIME（版本1.17）按照以下标准进行质量过滤：1）在10 bp 滑动窗口中平均质量得分＜20 的任何站点上，将250 bp的读数都截短，并丢弃截短的读数短于50 bp。2）精确的barcode 匹配，引物匹配中2 个核苷酸错配，包含歧义字符的读段被删除。3）仅重叠超过10 bp 的序列根据其重叠序列进行组装。无法组装的读物将被丢弃。使用UPARSE（7.1 版，http：//drive5.com/uparse/）对OUT 进行聚类，相似度为97%，并使用ucheime 对嵌合序列进行识别和去除。利用ucheime 对嵌合序列进行识别和去除。利用50%的置信阈值，用uclust 对silva（SSU123）16sRNA 数据库分析了每个16sRNA 基因序列的亲缘关系[27]。

1.4.2 Alpha 多样性分析

进行了基于Mothur v.1.21.1 的稀疏性分析[28]，以揭示多样性指数，包括Chao 和Shannon 多样性指数。热图是通过R 中的Vegan 2.0 包绘制的。

1.4.3 方差分析

有机质及土壤呼吸数据均通过方差分析进行统计学检验，3 个重复的平均数用IBM SPSS Statistics 20.0 进行邓肯检验（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 添加菌剂对各处理土壤呼吸的影响

对不同凋落物添加菌剂后发现，随着培养时间延长，各个处理土壤呼吸速率均呈现先降低后增长再降低的趋势。在试验刚开始时，各处理呼吸速率在2.31～6.05 μmol·m-2·s-1之间，直到培养结束，各处理呼吸速率处于0.12～1.27 μmol·m-2·s-1之间。其中，桉树添加益加益处理呼吸速率在培养21 d 后开始超过其他处理，并于培养42 d 和培养结束时显著高于所有处理。与未添加菌剂的对照相比，添加菌剂显著提升了土壤呼吸效率，综合比较各凋落物添加益加益菌剂的呼吸速率均高于添加其他菌剂，益加益对土壤呼吸具有较好的促进作用。

2.2 菌剂对土壤有机质含量的影响

由表1 和表2 可知，与未添加菌剂的对照相比，添加菌剂后均提升了土壤有机质含量，但是可能由于培养时间较短及菌剂和凋落物添加数量的原因，各处理均没有显著差异。最高增幅为马尾松+益加益的处理，对比初始有机质含量提升了5.48%，其次为桉树+益加益和杉木+益加益的处理，培养结束后有机质含量比对照有机质含量分别提高了4.49%和4.17%。综合比较，松杉桉3 种凋落物均表现为添加益加益对有机质提升效果最佳。

图1 添加菌剂对各处理土壤呼吸的影响Fig. 1 Effects of microbial agents on soil respiration in different treatments

表1 添加菌剂对土壤有机质含量的影响Tab. 1 Effects of microbial agents on soil organic matter

2.3 菌剂对土壤细菌群落丰富度和多样性的影响

在对低质量的reads 和嵌合体序列进行过滤和去除后，共获得2 448 个OTUs，它们的相似度为97%。细菌群落α 多样性指数如图2 所示。各处理的的Chao1 指数表现为松益＞桉益＞杉韦＞桉韦＞松韦＞桉贝＞松贝＞杉益＞杉贝，松+益加益显著高于其他处理。此外，Shannon 指数表现为桉益＞松益＞桉贝＞杉韦＞松贝＞杉贝＞松韦＞桉韦＞杉益（图2b）。益加益对比其他菌剂具有更好的提升土壤细菌群落多样性的作用，尤其是对松树和桉树土壤效果提升最明显。

2.4 菌剂对土壤细菌群落组成的影响

图2 不同菌剂处理的Chao1(a)和Shannon(b)细菌群落多样性指数Fig. 2 Bacterial community diversity of Chao1 (a) and Shannon (b) index in different treatments

对相对丰度排名前20 位的土壤细菌门进行了分析（图3），在各处理土壤中，5 个主要门类为厚壁菌门（Firmicutes）相对丰度最高，占8.16%～99.52%，其次为变形菌门（Proteobacteria），占0.17%～90.31%；其它细菌门分别为放线菌门（Actinobacteria，0.02%～16.82%）、酸杆菌门（Acidobacteria，0.11%～6.41%）、和浮霉菌门（Planctomycetes ，0.06%～5.06%）。这5 个细菌门的相对丰度共占92.94%～99.91%。

图3 土壤细菌群落主要门的相对丰度Fig. 3 The relative abundance of soil bacterial community at major phylum levels

图4 FAPROTAX 功能注释聚类热图Fig. 4 Heatmap of FAPROTAX functional annotation clustering

2.5 功能注释聚类分析

通过对样品在数据库中的功能注释及丰度信息，绘制热图，并从功能差异层面进行聚类分析（图4）。结果表明：桉益处理细菌群落在硫化合物的呼吸作用纤维素化、甲醇氧化、甲基营养、芳香族化合物降解、木聚糖分解、碳氢化合物降解、芳烃降解、脂肪族非甲烷烃降解、硫代硫酸盐呼吸功能强度显著表达；松益处理细菌群落在好氧亚硝酸盐氧化、硝化作用、硫酸盐呼吸、硝酸盐还原、硝酸盐呼吸和氮呼吸能强度显著表达。

3 结论与讨论

土壤呼吸是生态系统碳循环过程中不可或缺的部分[29]，它受到土壤温度、湿度、有机质含量和土壤微生物等因素影响[30]。本研究结果表明，不同处理土壤呼吸速率具有明显的时间差异，在培养后期各处理土壤呼吸速率降低了69.28%～97.05%，说明不同菌剂对于不同凋落物分解促进效果不同，后期有些菌剂已经与凋落物基本反应完全，无法起到长期促进凋落物分解的作用。通过对不同菌剂相同凋落物的处理比较，总体呈现出马尾松＞杉木＞桉树叶的趋势，这与吴志东等[31]研究一致，但是与杨钙仁等[32]研究结果不同，可能是受到桉树林龄和菌剂的影响。

土壤呼吸的升高并不一定意味着土壤有机质分解与大气二氧化碳浓度之间存在正反馈，单独测量土壤呼吸并不能为评估土壤在气候变暖下是碳源或碳汇提供确凿的证据[33]。笔者通过对凋落物分解之后的土壤有机质含量进行测定，发现菌剂对于凋落物分解具有促进作用，虽然由于处理时间的限制，各处理没有呈现显著差异，但是由图1 可以看出，益加益菌剂到培养后期仍维持了较高的土壤呼吸速率，在田间长期施用可能可以促进土壤有机质的显著上升，这点需要配合田间试验进行检验。

凋落物分解对于土壤有机质的补充具有重要作用[34]。由于凋落物的添加引起土壤有机碳的增加，为微生物提供较多可利用碳源，微生物的数量增多；土壤微生物在土壤有机质和土壤养分循环转化等方面发挥着重要作用[35-36]。从土壤细菌群落组成结果可以看出，益加益可以显著提升松树和桉树Shannon 和Chao1 多样性和丰富度指数，说明菌剂添加对于提升微生物物种总数及多样性具有显著作用（图2），尤其是益加益提升效果最佳，表明益加益更能提高凋落物土壤中微生物的数量和活性，使微生物在养分丰富的条件下生长迅速。对比其他处理，马尾松及桉树添加益加益后，Firmicutes，Proteobacteria，Actinobacteria，Acidobacteria是相对丰度最高的4 个门，但是Proteobacteria门所占比例显著上升，Proteobacteria 门具有增加养分可利用性的作用[37]，表明添加益加益后可以有效提升植物对土壤养分的利用情况。

土壤微生物功能多样性与土壤功能关系密切，土壤微生物功能多样性是土壤功能的保证,同时也是恢复土壤功能的基础[38]。笔者的研究表明桉益处理芳香族化合物降解，碳氢化合物降解和芳烃降解等碳代谢的功能表达有强烈上升（图4），这与之前土壤呼吸的结果一致（图1），表明益加益对桉树叶有机质分解具有很好的促进作用。

本研究结果表明，通过对不同凋落物添加3 种菌剂显著增加了土壤呼吸速率，土壤有机质含量也得到了有效提升，对土壤微生物群落及功能多样性有明显的提升效果。其中益加益菌剂对凋落物分解及土壤有机质含量提升效果最佳，马尾松添加益加益处理对比初始有机质含量提升了5.48%，桉树添加益加益处理对比初始有机质含量提升了4.55%。并且马尾松处理和桉树处理添加益加益菌剂后，Chao1 指数和Shannon 指数显著上升，表明益加益显著改善了土壤微生物群落多样性，对于提升土壤地力及改善土壤生态环境具有重大促进作用。