经典名方当归四逆汤物质基准的关键质量属性研究

2021-05-27苗家燕高晓燕张志强蒋宇航刘雨涵关雅戈韩妮娜乔延江

分析测试学报 2021年5期

苗家燕，罗赣，高晓燕，张志强，蒋宇航，韩晨，刘雨涵，关雅戈，韩妮娜，乔延江

(1.北京中医药大学中药学院，北京 100029；2.北京康仁堂药业有限公司，北京 101301)

《人用药物注册技术要求国际协调委员会药物研发指导原则》[1]中提出，关键质量属性(CQAs)是用以保证产品质量的物理、化学、生物或微生物性质或特征，这些性质或特征应有适当的限度、范围或分布。经典名方的CQAs在上述基础上融合了中医药元素，是传承中医理论的重要介质。从传统汤剂到物质基准再到复方制剂，CQAs贯穿于经典名方研究的整个过程。在安全有效的前提下，经典名方复方制剂还应与其物质基准的CQAs保持一致。

当归四逆汤(DSD)出自东汉张仲景的《伤寒论》[2]，收录于《古代经典名方目录(第一批)》[3]。全方由当归、桂枝、白芍、细辛、木通、甘草和大枣7味药组成，方中当归甘温，养血和血以补虚，桂枝辛温，温经散寒以通脉，细辛温经散寒，助桂枝温通血脉，白芍养血和营，助当归补益营血，木通通利经脉以畅血行，大枣、甘草益气健脾，养血补虚，重用大枣，既合归、芍以补营血，又防桂、辛燥烈太过，伤及阴血，甘草调和诸药，全方共奏温经散寒、养血通脉之效。DSD是治疗血虚寒厥证的代表方剂，临床上主要用于治疗雷诺病、痛经、肩周炎、糖尿病伴随周围神经病变等疾病[4-7]，其临床应用广泛，具有很好的开发价值。

物质基准作为经典名方的药用物质标准[8]，可为复方制剂的开发提供参照，在经典名方复方制剂开发过程中起着至关重要的作用。目前关于DSD物质基准关键质量属性研究的报道尚属空白。针对此问题，本文以DSD物质基准为载体，构建其高效液相色谱(HPLC)特征图谱，同时测定了DSD物质基准对应实物(DSD冻干粉)的出膏率和5种指标成分的含量，从全方化学轮廓与指标成分含量测定的角度对DSD物质基准进行质量评价与控制，完善DSD物质基准质量控制体系，以期为其复方制剂的开发提供科学依据。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Waters 2695高效液相色谱仪(美国Waters公司)；XP-6型百万分之一精密天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；KQ5200DA超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司)；Sorvall ST 8R高速冷冻离心机(赛默飞世尔科技有限公司)；陶瓷锅(曼达尼旗舰店)；LC-E013S电陶炉(广东顺德忠臣电器有限公司)；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)。

对照品阿魏酸(批号 DST191112-001)、芍药苷(批号 DST191024-070)、藁本内酯(批号 DST200610-007)、细辛脂素(批号DST190528-014)、甘草苷(批号 DST191027-009)、甘草酸铵(批号 DST190702-008)均购自成都德思特生物技术有限公司；对照品桂皮醛(批号110710-201418)购于中国食品药品检定研究院。上述对照品纯度>98%。色谱纯乙腈(赛默飞世尔科技有限公司)；分析纯甲醇、磷酸(国药集团化学试剂有限公司)；水为实验室自制超纯水。

1.2 药材

DSD中各药材产地信息见表1，经前期研究确定各药材的炮制方法，由北京康仁堂药业有限公司提供各批次饮片。经北京中医药大学杨瑶珺教授鉴定分别为伞形科植物当归Angelicasinensis(Oliv.)Diels的干燥根，樟科植物肉桂CinnamomumcassiaPresl的干燥嫩枝，毛茛科植物芍药PaeonialactifloraPall的干燥根，马兜铃科植物北细辛AsarumheterotropoidesFr.Schmidtvar.mandshuricum(Maxim.)Kitag的干燥根和根茎，木通科植物三叶木通Akebiatrifoliata(Thunb.)Koidz的干燥藤茎，豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch的干燥根和根茎，鼠李科植物枣ZiziphusjujubaMill的干燥成熟果实。

表1 当归四逆汤各药材产地信息Table 1 Origin information of medicinal materials of Danggui Sini Decoction

(续表1)

No.OriginAngelicae Sinensis Radix(当归)Cinnamomi Ramulus(桂枝)Paeoniae Radix Alba(白芍)Asari Radix et Rhizoma(细辛)Akebiae Caulis(木通)Glycyrrhizae Radix et Rhizoma(甘草)Jujubae Fructus(大枣)S4甘肃岷县广东肇庆亳州谯城吉林通化安徽霍山黑石渡镇甘肃定西山东枣庄S5甘肃岷县广东肇庆亳州谯城辽宁抚顺安徽霍山与儿街镇甘肃定西河北石家庄S6甘肃渭源县广东省肇庆四川德阳黑龙江牡丹江安徽霍山太阳乡内蒙古包头河北石家庄S7甘肃通渭县广西南宁亳州谯城辽宁抚顺安徽霍山诸佛庵镇内蒙古包头河北沧州S8甘肃岷县云南文山亳州谯城黑龙江牡丹江安徽霍山真龙地乡宁夏吴忠河北沧州S9甘肃岷县广东肇庆四川自贡吉林通化安徽霍山漫水河镇甘肃定西新疆哈密S10甘肃通渭县云南文山浙江金华黑龙江牡丹江安徽霍山太阳乡内蒙古包头新疆和田S11甘肃岷县广西南宁亳州谯城吉林通化安徽霍山道士冲乡内蒙古包头新疆和田S12甘肃通渭县广西玉林四川泸州辽宁抚顺安徽霍山但家庙镇内蒙古包头新疆阿克苏S13云南丽江玉龙自治县广西南宁浙江金华辽宁抚顺安徽霍山上土市镇宁夏吴忠新疆喀什S14云南丽江华坪县广东肇庆亳州谯城辽宁抚顺安徽霍山东西溪乡宁夏吴忠河北保定S15云南丽江永胜县广西南宁亳州谯城黑龙江佳木斯安徽霍山落儿岭镇宁夏吴忠山东枣庄

1.3 样品制备

1.3.1 当归四逆汤物质基准对应实物的制备《伤寒论》中记载的DSD的用法用量：“当归三两，桂枝三两(去皮)，芍药三两，细辛三两，甘草二两(炙)，通草二两，大枣二十五枚(擘)。上七味，以水八升，煮取三升，去滓，温服一升，日三服。”经考证，确定东汉一两相当于今日13.8 g[9]，一升相当于200 mL。因此确定处方剂量为当归、白芍、桂枝、细辛各41.4 g，木通、炙甘草各27.6 g，大枣25枚(破开去核)。分别称取相应批次处方量的当归、白芍、桂枝、细辛、木通、炙甘草和大枣置于3 L陶瓷锅内，加去离子水1 600 mL，电陶炉武火(8档)加热至煮沸后转文火(5档)煎煮60 min，趁热以300目尼龙筛网滤过，弃去药渣，放冷，定容至500 mL，即得DSD水煎液。取上述水煎液适量，于4 ℃、9 000 r·min-1条件下离心20 min后精密移取100 mL上清液置于恒重的蒸发皿中，冷冻干燥3 d即得DSD冻干粉，用于含量测定和特征图谱研究。

1.3.2 混合对照品溶液制备取芍药苷、阿魏酸、甘草苷、桂皮醛、甘草酸铵、细辛脂素和藁本内酯对照品适量，精密称定，分别置于7个容量瓶中，加甲醇配制成质量浓度分别为2.710、0.223、0.418、0.943、1.240、0.147、0.512 mg·mL-1的各对照品储备液；依次量取上述对照品储备液适量置于10 mL容量瓶中，加甲醇配制成质量浓度分别为26.000、23.000、10.500、23.600、106.000、33.200、 12.800 μg·mL-1的混合对照品溶液。

1.3.3 供特征图谱研究和4个指标成分含量测定用供试品溶液的制备取冻干粉0.45 g，精密称定，去离子水定容至10 mL，超声处理3 min至全部溶解，取1 mL在4 ℃、13 000 r·min-1条件下离心20 min的上清液用于DSD冻干粉的特征图谱研究及芍药苷、甘草酸铵、桂皮醛和藁本内酯的含量测定。

1.3.4 供细辛脂素含量测定用供试品溶液的制备取冻干粉0.85 g，精密称定，去离子水定容至10 mL，超声处理3 min至全部溶解后倒入50 mL分液漏斗中，以等量乙酸乙酯萃取两次，合并两次萃取后的乙酸乙酯层溶液于200 mL蒸发皿中，80 ℃水浴挥干溶剂，甲醇定容至2 mL，取1 mL在4 ℃、13 000 r·min-1条件下离心20 min的上清液用于细辛脂素的含量测定。

1.3.5 单味药样品及阴性样品溶液制备分别称取处方量的各饮片，按“1.3.1”项下水煎液制备方法，分别制备各单味药样品溶液以及缺各单味药的阴性样品溶液。

1.4 色谱条件

1.4.1 特征图谱色谱条件Phenomenex Luna®C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈(A)-0.05%磷酸水溶液(B)，梯度洗脱：0～8 min，5%～10%A；8～15 min，10%～13%A；15～24 min，13%～15%A；24～30 min，15%～17%A；30～34 min，17%～20%A；34～45 min，20%～30%A；45～50 min，30%～45%A；50～65 min，45%～80%A；65～67 min，80%～95%A；67～70 min，95%A。柱温30 ℃，体积流量1.0 mL·min-1，检测波长为230 nm和290 nm，进样量10 μL。

1.4.2 含量测定色谱条件Phenomenex Luna®C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈(A)-0.05%磷酸水溶液(B)，梯度洗脱：0～8 min，16%A；8～35 min，16%～50%A；35～45 min，50%～100%A；45～50 min，100%～16%A。柱温30 ℃，体积流量1.0 mL·min-1，检测波长230 nm和290 nm，进样量10 μL。

2 结果与讨论

2.1 当归四逆汤物质基准特征图谱的建立

2.1.1 精密度试验取同一批冻干粉(S3)供试品溶液，按“1.4.1”色谱条件连续进样6次。结果以芍药苷(230 nm)和桂皮醛(290 nm)为参照峰，各共有峰相对保留时间和相对峰面积的相对标准偏差(RSD)均小于3.0%，表明仪器精密度良好。

2.1.2 稳定性试验取同一批冻干粉(S3)供试品溶液，按“1.4.1”色谱条件，分别于样品制备后0、2、4、8、12、24、48 h进样，结果显示，各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3.0%，表明供试品溶液在48 h内稳定性良好。

2.1.3 重复性试验平行制备同一批冻干粉(S3)供试品溶液6份，按“1.4.1”色谱条件进样，结果显示，各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3.0%，表明该方法重复性良好。

2.1.4 特征图谱建立及相似度评价采用“1.3.3”方法制备15批冻干粉供试品溶液，按“1.4.1”色谱条件进行分析。将15批物质基准HPLC数据导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，以S1样品图谱为参照图谱，时间窗宽度设定为0.1 min，采用中位数法，进行多点校正和全谱峰匹配，得到230 nm和290 nm下15批物质基准特征图谱(S1～S15)及共有模式(软件基于15批物质基准的图谱拟合出的对照图谱，包含15批物质基准的共有信息，R)(图1)，混合对照品的色谱图见图2。特征图谱中共标记45个共有峰，共有峰45为当归特征峰，共有峰42、43、44为桂枝特征峰，共有峰7、8、9、16、20为白芍特征峰，共有峰34、35、36、37、38为细辛特征峰，共有峰11、22、24、26、28、29、32、33为甘草特征峰，共有峰15为木通特征峰。经与对照品比对共指认7个共有成分，分别是9号峰芍药苷、10号峰阿魏酸、11号峰甘草苷、32号峰甘草酸铵、36号峰细辛脂素、43号峰桂皮醛、45号峰藁本内酯。以生成的共有模式为参照，15批物质基准特征图谱与对照图谱的相似度均大于0.89。

特征图谱应尽量多的呈现药材的特征成分信息，兼顾各指标成分的响应强度，故本研究选择不同波长进行检测。根据药典中各指标成分的检测波长，拟选定230 nm和290 nm作为DSD色谱分析的检测波长。通过对冻干粉供试品溶液进行全波长扫描(210～400 nm)发现，230 nm下色谱峰数量多，290 nm下藁本内酯和桂皮醛色谱峰峰形好，吸收强。因此，确定特征图谱和含量测定的检测波长为230 nm和290 nm。

2.2 当归四逆汤物质基准的出膏率

按“1.3.1”方法制备DSD冻干粉，测定出膏率，计算公式为出膏率=(m/M)×100%，式中m表示冻干粉的质量，M表示饮片投料量，结果见表2。15批物质基准出膏率为13.37%～16.64%，平均值为15.00%，RSD为6.1%。

2.3 当归四逆汤物质基准的多成分含量测定

2.3.1 系统适应性试验以“1.3.3”和“1.3.4”方法分别制备用于4个指标成分与细辛脂素含量测定的供试品溶液，按照“1.4.2”色谱条件测定混合对照品溶液、冻干粉的供试品溶液、7个单味药及其阴性样品溶液。结果显示样品中芍药苷、桂皮醛、甘草酸铵、细辛脂素和藁本内酯的分离度和理论塔板数均较好，且阴性无干扰，可进行含量测定。

2.3.2 线性关系考察精密吸取按“1.3.2”制备的芍药苷、桂皮醛、甘草酸铵、细辛脂素和藁本内酯各对照品储备液，配制成系列浓度的对照品溶液，于“1.4.2”条件进行色谱分析。记录不同质量浓度(X)对照品的色谱峰面积(Y)，拟合得到线性回归方程为：芍药苷Y=12 588X-89 698(r=0.998 3)，桂皮醛Y=110 079X+181 094(r=0.999 4)，甘草酸铵Y=392 7.5X-26 446(r=0.999 1)，细辛脂素Y=12 697X+5 827.8(r=0.999 9)，藁本内酯Y=19 054X+36 541(r=0.999 9)。结果表明，上述成分依次在0.016 9～2.71、0.000 118～0.236、0.007 72～1.24、0.460～147、0.000 512～0.512 μg·mL-1的范围内线性关系良好。

图1 230 nm(A)及290 nm(B)下15批当归四逆汤物质基准的HPLC特征图谱(S1～S15) 及当归四逆汤物质基准的HPLC对照图谱(R)Fig.1 HPLC characteristic chromatogram of 15 batches substance benchmarks of Danggui Sini Decoction (S1～S15) and HPLC reference chromatogram of substance benchmarks of Danggui Sini Decoction (R) at 230 nm(A)and 290 nm(B)

图2 230 nm和290 nm下当归四逆汤混合对照品溶液色谱图Fig.2 Chromatograms of Danggui Sini Decoction mixed control solution at 230 nm and 290 nm A:230 nm,B:290 nm;9.paeoniflorin(芍药苷) ,10.ferulic acid(阿魏酸),11.liquiritin (甘草苷),32.ammonium glycyrrhizinate (甘草酸铵),36.asarinin(细辛脂素),43.cinnamaldehyde (桂皮醛),45.ligustilide(藁本内酯)

2.3.3 精密度试验取同一批冻干粉(S3)供试品溶液，按“1.3.3”和“1.3.4”方法分别制备用于4个指标成分与细辛脂素含量测定的供试品溶液，按“1.4.2”色谱条件连续进样6次。结果显示各成分峰面积RSD均小于2.0%，表明仪器精密度良好。

2.3.4 稳定性试验取同一批冻干粉(S3)供试品溶液，按“1.3.3”和“1.3.4”方法分别制备用于4个指标成分与细辛脂素含量测定的供试品溶液，按“1.4.2”色谱条件分别于样品制备后0、2、4、8、12、24、48 h进样。结果显示各成分峰面积RSD均小于2.0%，表明供试品溶液在48 h内稳定性良好。

2.3.5 重复性试验平行制备同一批冻干粉(S3)供试品溶液6份，按“1.3.3”和“1.3.4”方法分别制备用于4个指标成分与细辛脂素含量测定的供试品溶液，按“1.4.2”色谱条件进样。结果显示各成分峰面积RSD均小于2.0%，表明该方法重复性良好。

2.3.6 加标回收率试验取冻干粉(S3)0.25 g，精密称定，以指标成分含量的50%、100%、150%分别加入芍药苷、桂皮醛、藁本内酯和甘草酸铵对照品溶液各3份，按“1.3.3”方法制备供试品溶液；另取冻干粉(S3)0.85 g，精密称定，以细辛脂素含量的50%、100%、150%加入细辛脂素对照品溶液各3份，按“1.3.4”方法制备供试品溶液。上述各供试品溶液按“1.4.2”条件进行色谱分析。结果显示5种成分的加标回收率为95.0%～105%，RSD为1.7%～2.4%，表明该方法准确可靠。

2.4 样品含量测定

采用“1.3.3”和“1.3.4”方法分别制备15批冻干粉供试品溶液，按“1.4.2”条件进样。如表2所示，15批物质基准中芍药苷、甘草酸铵、细辛脂素、桂皮醛和藁本内酯的含量分别为8.226～13.46、1.929～6.535、0.020 02～0.034 30、0.076 61～0.543 3和0.075 94～0.140 6 mg·g-1。

表2 15批当归四逆汤物质基准的出膏率及5种指标成分的质量分数Table 2 Yield of dry extract and mass fraction of 5 index components in 15 batches substance benchmarks of Danggui Sini Decoction

以2020年版《中国药典》中各药味的含测项为基础，结合各供试品溶液及混合对照品溶液的色谱图综合分析，以含量高、性质稳定、无阴性干扰、易于检测、峰形良好且保留时间适中为原则，选择芍药苷、甘草酸铵、细辛脂素、桂皮醛作为指标成分进行DSD物质基准的含量测定研究。药典中对当归饮片缺少质控成分，而当归中主要为挥发油和有机酸，其中含量最高的为藁本内酯和阿魏酸[10-12]，但阿魏酸存在阴性干扰，且不具有专属性，故将藁本内酯纳入含测项；最终确定藁本内酯、桂皮醛、芍药苷、细辛脂素和甘草酸铵作为含量测定的指标成分。

对15批DSD冻干粉的指标成分进行含量测定，发现芍药苷、细辛脂素和藁本内酯的含量为均值的70%～130%[13]，3个批次的桂皮醛和10个批次的甘草酸铵含量超出了均值的70%～130%。对处方中的各药材及其饮片进行含量测定，发现药材和饮片中同批次的桂皮醛和甘草酸铵也超出含量均值的70%～130%，由此说明饮片质量的均一性是保证经典名方关键质量属性一致性的必要条件。

将特征图谱中的45个共有峰进行药材归属，结果显示，除大枣外其余药味均存在特征峰，故需对大枣进行单独的质控研究。首先，采用HPLC对大枣中的白桦脂酸、齐墩果酸进行检测[14]，但在紫外检测器(UV)和蒸发光散射检测器(ELSD)下二者均未检出，推测以上两个成分的极性较弱，难以煎出。据报道，大枣的主要成分为氨基酸和多糖[15]，但方中当归也富含多糖，故无法对大枣多糖进行薄层色谱(TLC)鉴别。尝试对大枣氨基酸进行薄层鉴别[16]，发现阴性样品亦存在严重干扰。因此需进行后续研究以实现对大枣的质量控制。