非洲猪瘟病毒检测方法的研究进展

杨湛森，蒋雅楠，程 楠，李相阳，黄昆仑， 刘清亮，孙艳丽，许文涛*

(1.中国农业大学 食品科学与营养工程学院，北京 100083；2.北京农学院 食品科学与工程学院，北京 102206；3.山东拜尔检测股份有限公司，山东 潍坊 261061)

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是一种影响各个品种与年龄段猪的毁灭性传染病[1]，其特征包括高烧，皮肤发绀，淋巴严重出血，死亡率高达100%，被世界动物卫生组织(International Epizootic Office，OIE)列为必须及时通报的动物疫病，对养猪产业构成了巨大威胁，我国也将其列为主要的外来动物疾病[2-3]。非洲猪瘟是由双链DNA虫媒病毒——非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起的，它是非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属的唯一成员[2,4]，具有复杂的二十面体结构，直径约200 nm，基因组大小在170～190 kb范围之间[5]。非洲猪瘟病毒首次报道于1921年的肯尼亚[6]，在20世纪中叶于欧洲、南美爆发，90年代在欧洲大部分地区被消灭后仍流行于意大利撒丁岛[7]。2007年，非洲猪瘟首次进入俄罗斯高加索地区格鲁尼亚，并传播到乌克兰(2012)、白俄罗斯(2013)、立陶宛(2014)、爱沙尼亚(2014)、波兰(2014)、拉脱维亚(2014)、罗马尼亚(2017)、捷克共和国(2017)和匈牙利(2017)等东欧其他国家，2018年在我国沈阳发现首例非洲猪瘟病毒疫情报道[6]。2019年的越南同样爆发了非洲猪瘟疫情[8]。2020年以来，全球共有26个国家和地区发生了2 300起家猪和7 437起野猪共9 737起非洲猪瘟疫情[9],对全球养猪业构成了巨大威胁，造成了巨额经济损失[10]。

目前，尚未有针对非洲猪瘟病毒的特效药和疫苗，其主要的防控策略依靠卫生措施的实施以及对感染或暴露动物的屠宰[11]。因此，非洲猪瘟病毒的检测与早期诊断对于疫情确认和控制至关重要。世界动物卫生组织建议的非洲猪瘟病毒检测方法包括病毒分离、荧光抗体检测以及实时和常规聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)检测[12]。本文根据非洲猪瘟病毒的检测原理将其检测方法分为病毒分离方法、免疫学检测方法与分子学检测方法，对各方法的原理和特点进行简单介绍，并对非洲猪瘟病毒检测的研究进展进行了综述。

1 病毒分离法检测非洲猪瘟病毒

1960年，Malmquist等[13]开发了病毒分离法即红细胞吸附试验(Haemadsorption test，HAD test)，其原理是猪红细胞会吸附在感染非洲猪瘟病毒的猪单核细胞或巨噬细胞的表面，这些细胞可从猪血液、肝脏、脾脏、淋巴结和扁桃体等组织器官中分离[14]。HAD试验的阳性结果对非洲猪瘟的诊断是决定性的，是非洲猪瘟病毒的特异性反应，但该方法也存在一些缺陷，包括：对于试验要求的技术手段较高，阴性诊断由于原代细胞培养的缘故费时费力，部分非洲猪瘟病毒没有红细胞吸附现象存在假阴性，因此通常作为其他方法的参考与补充参与非洲猪瘟病毒的检测。

2 免疫学方法检测非洲猪瘟病毒

免疫学检测方法可根据检测靶标的不同分为抗原检测与抗体检测，其中因非洲猪瘟病毒抗体在被感染后的几个月或几年中依旧存在，因此可依此发现幸存的感染动物[15]。免疫学检测方法根据检测手段可分为免疫荧光试验、免疫印迹试验、酶联免疫吸附试验与免疫层析试纸等。目前，在非洲猪瘟病毒的54个结构蛋白中，有19个蛋白的编码基因是已知的，除此之外，非洲猪瘟病毒也有一些非结构蛋白，这些蛋白在满足要求的情况下可作为免疫学方法检测的靶标[16-18]，非洲猪瘟病毒蛋白与其编码基因信息见表1。

表1 非洲猪瘟病毒蛋白与其编码基因Table 1 Proteins of ASFV and these coding genes

2.1 免疫荧光试验

免疫荧光试验可分为荧光抗体试验(Fluorescent antibody test，FAT)与间接荧光抗体试验(Indirect fluorescent antibody test，IFAT)，其区别在于检测靶标是非洲猪瘟病毒抗原还是因其产生的抗体。荧光抗体试验原理是利用荧光标记的抗体与抗原形成抗原抗体复合物颗粒，再通过显微镜检测，该方法可用来检测感染非洲猪瘟病毒的猪组织涂片或切片中的病毒抗原。间接荧光抗体试验是利用荧光标记的非洲猪瘟病毒二抗检测样品中因抗原产生的抗体，如Heuschele等[19]利用免疫荧光试验实现了对不产生红细胞吸附的非洲猪瘟病毒的检测。

2.2 免疫印迹试验

免疫印迹试验(Immunoblotting test)的原理是将凝胶电泳分离后的蛋白固定于印迹纸上，通过类似于免疫荧光试验的直接或间接方法，实现对非洲猪瘟抗原或抗体的检测，其信号由荧光或酶促反应产生。免疫印迹试验具有高通量、敏感度高、特异性强等优点，但其对试验条件与仪器设备有较高要求。Barderas等[20]利用粉纹夜蛾(Trichoplusiani)幼虫制备了非洲猪瘟病毒重组蛋白p30，并通过实验优化确定25 μg总幼虫蛋白提取物固定到硝酸纤维素条上时可得到最优结果，且在进行正常猪血清测试时得到了阴性结果。Sakamoto等[21]利用昆虫细胞表达了非洲猪瘟重组蛋白p32和p54，在5种抗病毒血清的测试中得到了阳性结果，在正常猪血清测试中得到了阴性结果。Kazakova等[22]制备了高纯度重组蛋白p30，开发了基于高纯度重组蛋白p30的免疫印迹检测系统，对家猪和野猪或自然性感染非洲猪瘟病毒的血清和器官样本进行测试，方法的特异性和敏感性分别为98.75%与100.00%，其高灵敏度使得该方法可检出感染非洲猪瘟病毒6～8 d的病猪免疫器官或血清中的非洲猪瘟病毒特异性抗体。

2.3 酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)的基本原理是通过与酶分子共价结合的抗体与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性反应，在有底物溶液存在的情况下，酶分子催化发生颜色反应，由于检测方法的不同(直接ELISA、双夹心ELISA、间接ELISA等)，靶标浓度与颜色深浅呈不同关系。如Barderas等[20]和Sakamoto等[21]同样利用制备的重组蛋白p30(p32)和p54进行间接ELISA，确认了这几种重组蛋白在针对非洲猪瘟病毒产生的特异性抗体检测中的潜力。Perez-Filgueira等[23]利用重组蛋白p30开发的ELISA方法对来自西班牙的样本检测结果显示出相似于传统ELISA的灵敏度和更高的特异性，且对实验动物感染的早期检测也呈现更高的灵敏度，对比来自西班牙和非洲的样本，其抗原性的变异会影响基于重组蛋白p30的ELISA检测，但这种方法仍是一种可用于发展中国家非洲猪瘟检测的廉价可行策略。Hutchings等[24]开发了两种间接夹心ELISA法检测非洲猪瘟病毒抗原：一种是利用兔和豚鼠培养的抗细胞质可溶性非洲猪瘟蛋白的多克隆血清；另一种是利用非洲猪瘟VP73蛋白的单克隆抗体与兔多克隆血清，这两种方法均能检出具有代表性的、系统遗传学上不同的非洲猪瘟病毒抗原，但使用多克隆血清时的灵敏度更高。Cubillos等[25]同样利用从东非分离株分离出的重组蛋白p30进行了ELISA试验，发现基于该重组蛋白p30的ELISA能够准确检出非洲猪瘟病毒。Giménez-Lirola等[26]通过对比p30、p54与p72 3种重组蛋白，最终选择重组蛋白p30为基础构建间接双夹心ELISA法，该方法能够完成猪血清和口腔液中非洲猪瘟病毒特异性抗体的检测。除此之外，商品化的ELISA试剂盒和传统ELISA也被广泛应用于非洲猪瘟病毒的检测[27-29]。

2.4 免疫层析试纸

随着纳米粒子与显色手段的发展，免疫层析试纸已不局限于胶体金试纸。免疫层析试纸的夹心法原理是形成显色粒子抗体-抗原复合物后，被检测线处抗体捕获；其竞争法原理是影响阴性条件下检测线处显色复合物的形成。检测线在靶标存在与否时呈现显色或不显色的情况，质控线是为了确认试纸能够正常检测而存在，一般能够直接捕获显色粒子标记的抗体而显色。最近几年关于免疫试纸的研究主要集中于多重检测和其他检测信号的开发。Sastre等[2]通过不同颜色的羧基化乳胶微球，基于非洲猪瘟病毒衣壳蛋白VP72与经典猪瘟病毒(Classic swine fever virus，CSFV)结构蛋白E2构建了可同时检测非洲猪瘟病毒特异性抗体和经典猪瘟病毒特异性抗体的双重试纸，发现其在这两种疾病诊断方面具有潜力。Sastre等[30]开发了一种基于非洲猪瘟病毒衣壳蛋白VP72单克隆抗体的抗原检测免疫层析试纸，利用黑色和蓝色的羧基化乳胶微球分别进行检测和质控，该免疫层析试纸在实验感染样本检测中具有和抗原ELISA很好的相关性，但不如PCR，在实际样品检测中则略优于ELISA，特异性接近100%。Li等[31]利用重组蛋白p54与含铕荧光微球构建了检测非洲猪瘟抗体的快速检测方法，最佳检测条件下可在20 min内仅需75 μL血清即可检出靶标，具有较高特异性，检测结果与ELISA试剂盒一致，准确性和可重复性高，成本低，适用于我国非洲猪瘟病毒的检测。

2.5 其他免疫学检测方法

Abad等[32]设计了一种压电石英晶体微平衡(Quartz crystal microbalance，QCM)生物传感器用于检测非洲猪瘟病毒附着蛋白p12的抗体，可在30 min内检出结果，性能优于ELISA，但没有ELISA的高通量优势。其原理是利用抗原抗体的结合反应，引起质量敏感的压电晶体共振频率的变化，通过对这种变化的检测实现对非洲猪瘟病毒的检测。类似的，Uttenthaler等[33]通过压电石英晶体微平衡设计了一种直接压电注射免疫分析法用于非洲猪瘟病毒特异性多肽单克隆抗体18BG3和病毒蛋白VP73的检测。

Luminex悬浮芯片技术(Suspension array technology，SAT)也称xMAP(Flexible multiple-analyte profiling)，其原理是以不同比例荧光标记聚苯乙烯微球和磁性微球偶联蛋白、核酸等分子，与靶标结合后由流式细胞仪检测。Aira等[34]利用xMAP技术开发了同时检测非洲猪瘟病毒的特异性蛋白VP72的抗体、VP30的抗体和经典猪瘟病毒的特异性蛋白E2的抗体的检测方法，灵敏度优于ELISA。

Szeredi等[35]使用一种商业化小鼠单克隆抗体(Clone 1BC11)，在细胞培养中利用免疫细胞化学(Immunocytochemical，IC)方法，在组织样本中利用免疫组织化学(Immunohistochemical，IHC)方法对非洲猪瘟病毒衣壳蛋白p72进行检测，证明了这两种方法在非洲猪瘟研究和诊断中是可以使用的辅助性实验室检测方法，其原理类似于免疫荧光试验，区别在于将荧光标记信号改变为染色信号。

3 分子学方法检测非洲猪瘟病毒

ASFV全基因组大小在170～190 kb之间，具有数量在151～167之间的开放阅读框架[5,17]，进行分子学检测首先需寻找非洲猪瘟病毒基因组中足够保守又区别于其他进化关系比较近的病毒序列，因此分子学检测方法有必要对此进行验证，以确保该方法可检测到所有流行的非洲猪瘟病毒，且不会因为其他关系较近病毒而发生误判，非洲猪瘟病毒中编码蛋白的部分基因见表1。分子生物学检测方法主要包括聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)、等温扩增技术(Isothermal amplification techniques)、成簇规律间隔的短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)系统等。

3.1 聚合酶链式反应

PCR是利用双链扩增的原理，在引物、酶、4种脱氧核糖核苷酸存在的情况下，在生物体外对特定的DNA片段进行指数扩增，得到该片段的大量拷贝。PCR是一种常用的非洲猪瘟病毒实验室检测方法，也是最为常见的实验室分子生物学诊断方法之一。Agüero等[36]基于VP73基因提供了一种高灵敏的热启动PCR检测方法，可用于非洲猪瘟检测的常规实验。Basto等[37]利用巢式PCR检测了游走鸟壁虱体内的非洲猪瘟病毒，相较于病毒分离法与普通PCR法，该方法具有更好的敏感性，其引物来自于非洲猪瘟VP72基因。Giammarioli等[38]建立了一种能够同时检测经典猪瘟病毒、非洲猪瘟病毒、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)、猪繁殖与呼吸综合症病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)、猪细小病病毒(Porcine parvovirus，PPV)的多重热启动PCR检测方法，该方法需先进行一步逆转录，其性能可满足常规分子诊断需要。Luka等[39]从福尔马林中的固定和非固定组织中进行DNA提取，然后进行PCR，证明了利用传统方法提取这些样品的DNA反应效果更好。Peng等[40]建立了可同时检测非洲猪瘟病毒和猪水疱病病毒(Swine vesicular disease virus，SVDV)的双重PCR反应，其中检测非洲猪瘟病毒的引物是针对p72蛋白的基因设计的。Luo等[11]针对非洲猪瘟病毒VP72基因开发了一种新型PCR方法，该方法通过重新设计通用引物，使得该方法相较于OIE推荐的常规PCR方法在检测部分基因型的ASFV时具有更高的灵敏度。Erickson等[41]利用多重反转录PCR与自动电子芯片检测了包括非洲猪瘟病毒、经典猪瘟病毒、猪水疱病病毒、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合症病毒、口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)、猪水疱疹病毒(Vesicular exanthema of swine virus，VESV) 7种猪病毒，其中非洲猪瘟病毒的检测限为10 copies/μL。Xiao等[42]构建了基于悬浮阵列系统的多重PCR检测非洲猪瘟病毒、经典猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪细小病毒、伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)、日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV) 7种猪病毒，检出限为1 000 copies/μL，在猪相关病毒的检测中是一种具有潜力的方法。Zeng等[43]将PCR方法与侧流试纸结合，实现了非洲猪瘟病毒的快速检测，该方法与经过OIE验证的实时PCR方法符合率为89.67%，Kappa值为0.763(p<0.001)，与商用试剂盒的符合率为97.67%，Kappa值为0.950(p<0.001),表明该方法适用于非洲猪瘟病毒的现场检测。

实时荧光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative PCR，RTFQ PCR)是利用荧光染料或荧光标记的特异性探针标记跟踪PCR扩增产物，将PCR与光谱结合的核酸定量检测技术，具有灵敏度高、特异性好、闭管操作污染小、可定量与避免电泳污染等优点。King等[44]建立的基于非洲猪瘟病毒VP72基因的快速检测非洲猪瘟病毒的闭管PCR方法，首次将实时荧光定量PCR应用于非洲猪瘟的检测，并成为被OIE推荐的非洲猪瘟病毒检测方法。作为一种极有价值的疑似病例鉴别分子学方法，实时荧光定量PCR研究一直是较为热门的方向(表2)。Ronish等[45]通过大量扩增的非洲猪瘟病毒VP72基因的指数后线性PCR(Linear-after-the-exponential-PCR，LATE-PCR)建立了一种荧光信号读取于PCR扩增终点的新型检测方法，该方法是区别于RTPCR的荧光定量PCR方法，检测限可达1 copie。

表2 利用实时荧光定量PCR检测非洲猪瘟病毒的研究Table 2 The research of the detection of ASFV use RTFQ PCR

3.2 等温扩增技术

相较于PCR技术而言，等温扩增技术无需专业热循环仪，更适用于现场检测与非实验室的环境下检测。目前，已开发出包括环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)、交叉引物扩增技术(Cross priming amplification，CPA)、多重交叉替代扩增技术(Multiple cross displacement amplification，MCDA)、滚环扩增技术(Rolling circle amplification，RCA)、重组聚合酶扩增技术(Recombinase protein amplification，RPA)、重组聚合酶辅助扩增技术(Recombinase-aided amplification，RAA)、解旋酶依赖扩增技术(Helicase-dependent amplification，HDA)、杂交链式反应(Hybridization chain reaction，HCR)、指数扩增技术(Exponential amplification reaction，EXPAR)等多种等温扩增技术。本课题组在等温扩增技术应用于各种靶标的检测方法开发领域也进行了一定工作，包括利用RPA和LAMP对食品病原体和转基因食品进行检测[56-59]、利用HCR对脂多糖进行检测[60]、利用EXPAR对microRNA进行检测[61]等。

3.3 CRISPR/Cas系统

CRISPR即成簇规律间隔的短回文重复序列，又称常间回文重复序列丛集，是原核生物基因组内的一段重复序列。CRISPR/Cas系统是原核生物的“免疫系统”，利用CRISPR序列中来自于攻击过该生物的病毒基因片段结合外来核酸片段，启动CRISPR相关联蛋白(CRISPR-associated proteins，Cas)对外来核酸片段进行摧毁，保护自身核酸。根据这一系统的原理，可对非洲猪瘟病毒进行检测，该方法灵敏度极高。利用CRISPR/Cas系统对于非洲猪瘟病毒检测的研究在最近是非常热门的方向，如表3所示。

表3 利用CRISPR/Cas系统检测非洲猪瘟病毒的研究Table 3 The research of the detection of ASFV use CRISPR/Cas system

(续表3)

Sequence numberTargetDetection principleLODReference9p72After the CRISPR/Cas12a system was used to simultaneously cleave the RAA amplicon and the FAM-Biotin ssDNA reporter,the AuNPs-anti FAM antibody conjugates can through the control line to the test line form a red band(利用CRISPR/Cas12a系统同时裂解RAA扩增子与FAM和生物素双标记的ssDNA报告分子后,金纳米FAM抗体共轭物可以通过质控线在检测线形成红色条带)6×105 copies/mL[82]10VP72After the CRISPR/Cas12a system was used to simultaneously cleave the PCR amplicon or RPA amplicon and the ssDNA,the AuNPs-DNA probes conjugates lose the linker and turn to red(利用CRISPR/Cas12a系统同时裂解PCR扩增子或RPA扩增子和ss-DNA后,金纳米DNA探针共轭物失去连接子,变为红色)200 copies[83]

3.4 其他分子学检测方法

原位杂交技术(In situ hybridisation，ISH)是利用核酸碱基互补配对的原理，使被标记的外来核酸探针和被固定好的样本内的核酸结合，根据标记采用不同的检测手段，使该核酸在样本中的位置显现的方法。Ballester等[84]开发了一种新的原位杂交技术，设计了3种探针：p30、p54、p72 3种结构蛋白基因互补的3种寡聚核苷酸链(40nt)、Ba71L基因组的18.5 kb片段、E75L全基因组，其中后两种探针经地高辛标记后均可用于福尔马林固定和石蜡包埋中的组织细胞的原位杂交。

光在由光密介质进入光疏介质发生全反射时，入射光会透过光疏介质一个波长距离的深度后再沿界面流动半个波长距离后返回光密介质，这段透过光疏介质的波被称为倏逝波。表面等离子共振(Surface plasmon resonance，SPR)现象是光在棱镜与金属膜表面发生全反射时，倏逝波与金属中存在的离子波若发生共振，导致入射光的能量被离子波吸收，使反射光能量减弱。Biagetti等[85]建立了基于表面等离子共振原理的生物传感器，利用固定核酸(Locked nucleic acid nucleotides，LNA)代替单链核酸作为VP72基因保守区域的互补原件构建了倏逝波/共振镜(Evanescent wave/resonant mirror)光学生物传感器，固定核酸与靶标双链形成三核酸结构后，质量发生改变导致折射指数发生改变进而被检测出来，其检测限与定量限为178 copies与245 copies。

4 总结与展望

近年来，非洲猪瘟病毒在全球范围内依旧是养猪业的重大威胁，其检测方法的研究进展对于非洲猪瘟病毒早期诊断至关重要，对疫情确认和控制具有重要意义。本文所提到的非洲猪瘟病毒检测方法的检测能力与适用场景尚存在一定不足(表4)，针对这些存在的问题，非洲猪瘟病毒的检测方法应用需在保证灵敏度和特异性的情况下，提高其检测限与现场即时诊断能力，未来关于非洲猪瘟病毒的研究应集中于低成本、工业化、高通量、高性能等方向，分子学检测方法在提高非洲猪瘟病毒的检测性能方面十分有效，将分子学检测方法与目前已经实现产业化生产的试纸、试剂盒、微流控等相结合可以降低成本、提高检测通量。

表4 非洲猪瘟病毒检测方法汇总表Table 4 The summary sheet of african swine fever detection methods

(续表4)

Sequence numberMethodsAdvantagesLimitation5Polymerase chain reaction(聚合酶链式反应)Convenient operation,high specificity and sensitivity(操作方便、特异性好、灵敏度高)Need prefessional themal cycler,high-demand of instrument(需专业热循环仪,仪器设备要求高)6Isothermal amplification techniques(等温扩增技术)No prefessional themal cycler,suitable for field detection(无需专业热循环仪,适于现场检测)Aerosol contamination,false positive(气溶胶、假阳性)7CRISPR/Cas systemUltra high sensitivity(超高灵敏度)Need preamplication of nucleic acid,complex system(需核酸预扩增,体系复杂)