NaCl胁迫对宁夏枸杞组培苗抗氧化酶及相关基因表达模式的影响

方伟敏 弓淑桦 何卜卜 田世彪 赵会君

摘要：以宁杞1号无菌实生苗的叶片、下胚轴以及茎尖生长点组织为材料，以MS为基础培养基，设置不同的激素濃度比例，诱导不同外植体产生丛生芽并完成形态建成。采用水培处理方式，分别设置0、100、200 mmol/L NaCl胁迫梯度，于处理后1、2、3 d分别测定地上部超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）的活性，利用实时荧光定量PCR技术检测APX、Cu/Zn-SOD、GST、Fe-SOD基因的表达变化模式。结果表明，MS+1.0 mg/L 6-苄氨基嘌呤（6-BA）+0.2 mg/L萘乙酸（NAA）的培养基能快速诱导顶端组织及叶片组织中丛生芽的生长，而茎段呈现愈伤化和玻璃化情况，丛生芽在MS培养基上能完成生根，形态建成良好。盐胁迫下的叶片中保持着较高浓度的POD酶活性，而CAT活性却被抑制，与抗氧化胁迫相关的SOD、GST以及APX基因在盐胁迫下表达倍数显著性增加，而Fe-SOD酶基因却显著性被抑制，本研究为宁夏枸杞组培快繁体系的建立，组培苗抗盐机制提供了理论支持。

关键词：宁夏枸杞;组织培养;盐胁迫;抗氧化酶;实时荧光定量

中图分类号： S567.1+90.1文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2021）07-0057-05

收稿日期：2020-08-27

基金项目：北方民族大学国家级大学生创新项目（编号：201811407015）;宁夏自然科学基金（编号：2019A0040）。

作者简介：方伟敏（1997—），男，福建漳州人，研究方向葡萄与葡萄酒酿造。E-mail：fangweimin0505@sina.cn。

通信作者：赵会君，博士，讲师，研究方向为植物抗逆生物学。E-mail：zhaohuijun1022@163.com。

宁夏枸杞是宁夏回族自治区特色资源植物，宁夏枸杞中富含枸杞多糖、黄酮、多酚等多种成分，因此是药食同源性功能保健食品，具有极高的经济价值和药用价值[1-4]。由于宁夏枸杞分布广泛，对盐碱、干旱、冷冻等环境胁迫具有极强的耐受性，在河北省沿海盐碱地、新疆自治区、甘肃省等土壤贫瘠之地也得到了大面积引种种植，也是典型的植被恢复树种和经济树种[5]。

在植物抗逆机制中，抗氧化酶系统及其关键基因起到重要作用[6]，超氧化物歧化酶（SOD）一般可以分为Cu/Zn-SOD、Fe-SOD和Mn-SOD 3种，其关键基因Fe-SOD，Mn-SOD、Cu/Zn-SOD的高效表达，是保持SOD酶活性的主要因素，SOD酶基因能够受重金属、盐碱以及干旱等逆境环境的诱导而高效表达[7]。过氧化物酶（POD）主要是在植物受到迫害产生过氧化物时具有防御性的一种酶，细胞壁为首先受到重金属胁迫的部位，POD酶作为可以调节细胞壁代谢的一种酶，可以减轻植株受迫害的程度，同时，POD酶还参与细胞壁木质素形成和细胞凋亡等生理活动[8-10]。过氧化氢酶（CAT）是一种金属合成酶，其主要作用是使过氧化氢分解成氧和水，CAT也参了植物对逆境胁迫的响应[11]。

由于宁夏枸杞是异花授粉，遗传背景复杂，自然环境中野生群体之间的抗逆差异较大，甚至现有栽培品种之间的抗逆能力也有很大差别[12]，而关于宁夏枸杞单一遗传背景下组培苗的抗逆研究报道较少，在短期内要获得大量遗传背景单一的群体，须要建立宁夏枸杞的快繁体系，已有很多关于宁夏枸杞组培体系的报道[13-14]，但是通过愈伤诱导的方法会产生大量的玻璃化苗，并且试验周期太长。本试验以无菌枸杞实生苗为材料，以不同的组织为外植体，拟建立、优化无菌枸杞苗的组织培养快速繁殖体系，降低枸杞苗外植体褐化死亡率，降低枸杞外植体玻璃化率，缩短培养周期，通过对遗传背景单一稳定的组培苗的耐盐能力的研究，能够更加准确地揭示枸杞的抗盐机制，以期为宁夏枸杞组织培养快繁体系的建立和组培苗的盐碱地生长提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料种植

所有试验都于北方民族大学生物科学与工程分子生物学实验室进行。宁杞1号成熟饱满的种子经蒸馏水冲洗干净后，于超净台中经10%次氯酸钠溶液消毒8 min后，用无菌水冲洗2～3遍，然后接种到1/2 MS培养基上，在25 ℃培养箱中培养，待培养20 d左右时，茎尖和叶片组织接种于不同激素比例的诱导培养基上，用于愈伤及不定芽的诱导和遗传转化。

1.2 宁夏枸杞组培快繁体系的建立

将枸杞叶片及顶端生长点剪下（叶片经手术刀划伤）后接种于8种添加了不同激素的MS固体培养基中（pH值为6.0），激素配比见表1，每个处理重复5次，每个培养瓶中接种外植体20个，培养条件：温度为25 ℃，湿度为40%，光照12 h/d。每 15 d 继代1次，并记录愈伤及不定芽生长情况，统计玻璃化率。

1.3 组培苗的生根

选取生长健康的不定芽为生根外植体，配制不同激素比例的生根培养基进行生根培养，激素配比主要为1/2 MS+0.2 mg/L NAA （萘乙酸）+0.6 mg/L IBA（3-吲哚丁酸）、1/2 MS+0.2 mg/L NAA+0.2 mg/L IBA、1/2 MS+0.4 mg/L NAA+06 mg/L IBA以及MS培养基，20 d后观察生根情况。

1.4 组培苗的水培及处理

选取在MS培养基中生根的组培苗，移栽在1/2 Hogland（霍格兰）营养液中培养1周，换在全Hogland营养液中培养至10 cm高时用于抗氧化酶SOD、POD、CAT活性的测定及实时荧光定量PCR检测。

1.4.1 枸杞苗叶片中SOD、POD、CAT酶活性的测定

选取长势均匀一致的水培枸杞苗，在Hogland营养液中分别设置3种不同浓度梯度的NaCl（0、100、200 mmol/L），每个处理重复3次，于处理24、48、72 h后取样，分别称取每个处理的新鲜成熟叶片各0.5 g于研钵中，加5 mL酶提取液在冰浴中研磨均浆，于4 ℃ 12 000 r/min 离心20 min，吸取上清液即为酶粗提液。超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）的活性测定参考代其林等的方法[15-16]，每个处理重复3次，相关数据用软件计算方差和平均值。

1.4.2 枸杞苗的RNA提取及cDNA合成

选取长势均一的水培苗，经200 mmol/L氯化钠处理，于处理后0、2、12、24、48 h分别取新鲜叶片于液氮速冻，利用Invitrogen trizol试剂按照试剂盒说明书操作步骤提取总RNA并检测完整性，取1 μg总RNA经脱氧核糖核酸酶处理后用M-MLV逆转录酶（美国英杰生命技术有限公司）合成cDNA。

1.4.3 实时荧光定量PCR检测目的基因的表达

根据实验室已经建立的宁夏枸杞转录组数据库里的表达序列标签（EST）序列，筛选了Cu/Zn-SOD、Fe-SOD、APX、GST等与抗氧化胁迫相关的基因，利用Primer Express 3.0 软件设计实时荧光定量PCR引物，采用美国MX3000pTM qPCR 实时荧光定量PCR仪，以宁夏枸杞的β-actin基因作为内参基因[17]，SYBR Green realtime PCR Master mix[东洋纺（上海）生物科技有限公司]为荧光染料，模板采用稀释20倍的cDNA，重复3次，总反应体系为 20 μL，反应条件为95 ℃ 10 min;95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，45个循环。PCR结束后进行溶解曲线分析，所需引物序列见表2。

2 结果与分析

2.1 不同激素浓度处理对宁夏枸杞茎尖、下胚轴、叶片组织不定芽的诱导

由表3可知，宁杞1号的茎尖及叶片在不同激素浓度上的生长变化情况，经过30 d诱导，茎尖在激素浓度为M7（1.0 mg/L 6BA+0.2 mg/L NAA）培养基中丛生芽芽点生长较多而几乎没有明显的玻璃化情况，适合用于宁杞1号茎尖外植体不定芽的诱导，而叶片在M8（1.0 mg/L 6BA+0.4 mg/L NAA）培养基上经过诱导后产生的不定芽生长最好，无明显玻璃化，因此M8培养基可用于诱导叶片不定芽的形成。诱导的不定芽在MS培养基上就能快速完成生根，水培苗长势健康正常（图1）。

2.2 不定芽的快繁及生根

挑选5株丛生芽长势较好的外植体，将其丛生芽独立分开，分别进行继代培养，2周继代1次，继代3次后统计丛生芽数，统计结果见表4。经过2次继代后快繁群体迅速增加，且快繁出的植株长势良好，玻璃化率极低，因此，本试验所建立的快繁体系达到预期效果。将不定芽移栽在MS培养基上，经过20 d的生根培养，不定芽完成了完整的形态建成，根系生长良好，移栽在Hogland 营养液中生长正常。

2.3 不同浓度的NaCl胁迫对叶片SOD、POD、CAT抗氧化酶活性的影响

组培苗在100、200 mmol/L NaCl处理下的叶片组织中的CAT、POD及SOD酶活性见图2。

与CK相比，在不同浓度的NaCl胁迫下，CAT酶活性在100 mmol/L NaCl处理1 d后显著性增加，随着胁迫时间延长而下降，而POD酶活性在胁迫 3 d 后达到显著或极显著水平，SOD酶活性在 200 mmol/L 的NaCl处理1 d和2 d 后呈下降趋势，但是在胁迫3 d后增加，但没达到显著水平。

2.4 不同浓度的NaCl 胁迫对相关基因表达的影响

对4个与抗氧化胁迫相关的基因进行实时荧光定量PCR分析，结果见图3。与对照相比，APX基因在胁迫后48 h表达量显著性增加，是对照的4.6倍;Cu/Zn-SOD基因在处理后24 h显著增加，是对照的1.95倍，Fe-SOD基因的表达在处理后12 h就已开始显著被抑制，随着时间延长，在48 h时极显著降低，是对照的0.18倍，而GST基因随着胁迫时间延长，表达倍数在24 h达到了最高，是对照的6.28倍，4個基因对盐碱胁迫进行了积极响应。

3 结论与讨论

宁夏枸杞优良的抗逆性机制目前仍然是研究的重点之一[5]，目前枸杞主要以扦插的方式进行繁殖育种，而扦插受到自然环境等外界因素的影响。通过建立稳定优良的快繁体系，不仅可以保留枸杞原有的优良性状，也可以在短期内获得大量遗传背景单一的无性系，为后期的基础理论研究和育种提供理论和技术支持。

本研究选择宁杞1号无菌实生苗的茎尖和叶片为试验材料，以MS培养基为基本培养基，利用不同浓度配比的激素进行不定芽的诱导，筛选出不同外植体组织培养快速繁殖过程中适宜的培养基和激素浓度配比， 确定了MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA为茎尖生长点不定芽诱导的最佳培养基浓度，MS+1.0 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA为叶片不定芽诱导的最佳培养基，叶片或茎尖可以不通过愈伤再分化途径就可以培养产生不定芽，并进一步筛选到了最适不定芽增殖的培养基，大大地降低了玻璃化率，缩短了组培时间，不定芽最后经MS培养基培养就可以快速生根。

经过对这些遗传背景单一的组培苗进行盐碱胁迫，发现POD酶活性在叶片中存在极显著增加，表明POD在植物响应盐碱胁迫、清除过氧化物质的过程中起重要的作用，而CAT酶活性在叶片中随着时间延长都呈下降趋势，众多研究发现，随着盐碱浓度的增加和胁迫时间的延长，CAT酶活性呈现先上升后下降趋势[18]，高盐浓度显著抑制了CAT酶活性[9]。沈金玲等研究结果表明，盐胁迫下部分CAT酶基因的表达倍数降低[19]，因此推测，可能由于盐胁迫降低了CAT酶基因的表达倍数，从而影响了CAT酶的整体活性，这有待于后期继续研究;通过对SOD酶的2个基因的表达模式进行研究发现，Cu/Zn-SOD在胁迫后24 h显著性增加，而 Fe-SOD 基因却呈现被极显著抑制的趋势，这可能是导致SOD酶活性不高的主要原因之一。有研究表明，谷胱甘肽转移酶参与了植物对多种逆境胁迫的响应[20]，刘明坤通过将GST基因转入烟草中，显著提高了转基因烟草的耐盐性，GST和APX基因表达倍数极显著增加，暗示该基因能积极响应盐胁迫，可能在枸杞耐受盐碱胁迫中起到重要作用[21]。

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