miR-541-3p靶向SPOCD1基因通过Wnt/β-catenin信号通路抑制乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭①

戴 睿 林 萍 宋精玲 周 莹 杨 耘 唐 莹

（昆明医科大学科技成果孵化中心电子显微镜室，昆明650500）

乳腺癌是女性最常见恶性肿瘤之一，早期以手术切除以及放化疗等传统方法为主，但易转移、易复发、易产生抗性和毒副作用大。新出现的靶向治疗特异性强，毒副作用小，成为乳腺癌新的治疗方法［1-2］。miRNA是一类内源性非编码RNA，研究发现其参与乳腺癌的生长和转移，也参与细胞耐药和抵抗等，可作为临床诊断、预后标志及有效的治疗靶点［3-5］。有研究报道miR-541-3p在非小细胞肺癌组织和血浆中下调表达，与TNM分期和术后生存期相关，过表达miR-541-3p通过靶向转化生长影响因子2（transform growth interacting factor 2，TGIF2）抑制非小细胞肺癌细胞的生长和转移［6］。还有研究发现miR-541-3p在神经病理性疼痛大鼠海马中下调表达［7］。包含1个基因的SPOC结构域（SPOC domain containing 1 gene，SPOCD1）是属于S-Ⅱ（TFⅡS）家族的转录因子，有研究报道SPOCD1在胃肿瘤中过表达，敲除SPOCD1减少了胃癌细胞增殖，迁移和侵袭，以及裸鼠中异种移植肿瘤的生长［8］。SPOCD1在人咀嚼黏膜伤口愈合期间显著上调表达［9］。然而miR-541-3p和SPOCD1在乳腺癌中的表达及其对乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响尚未阐明。本实验旨在研究miR-541-3p和SPOCD1对乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及miR-541-3p是否通过调控SPOCD1影响乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

1 材料与方法

1.1 材料 正常乳腺上皮细胞MCF-10A和乳腺癌细胞MCF-7、T47D、Bcap-37购自美国菌种保藏中心（ATCC）；胎牛血清、RPMI1640培养基、荧光定量PCR试剂盒购自美国Thermo Fisher Scientific公司；RIPA蛋白裂解液、二辛可宁酸（bicinchoninic acid，BCA）试剂盒购自上海纯优生物科技有限公司；MTT试剂盒、膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素（Annexin VFITC）和碘化丙锭（PI）试剂盒、双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自北京Solarbio公司；抗体购自苏州泓迅生物科技股份有限公司；Transwell小室、Matrigel胶购自北京明阳科华生物科技有限公司；miRcon、miR-541-3p、anti-miR-con、anti-miR-541-3p、sicon、si-SPOCD1、pcDNA-con、pcDNA-SPOCD1载体质粒购自上海斯信生物科技有限公司。Thermo FC酶标仪购自美国Thermo公司；荧光倒置显微镜购自日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 正常乳腺上皮细胞MCF-10A和乳腺癌细胞MCF-7、T47D、Bcap-37用RPMI1640培养基（含10%胎牛血清）在37℃、5%CO2条件下培养，细胞融和至80%～90%时消化传代。

1.2.2 细胞处理与分组 取对数生长期细胞MCF-7无血清培养12 h后更换培养基，将miR-con、miR-541-3p、anti-miR-con、anti-miR-541-3p、si-con、si-SPOCD1分别转染至MCF-7细胞中，分别记为miRcon组、miR-541-3p组、anti-miR-con组、anti-miR-541-3p组、si-con组、si-SPOCD1组；将miR-541-3p质粒分别与pcDNA-con、pcDNA-SPOCD1共转染至MCF-7细胞中，分别记为miR-541-3p+pcDNA-con组、miR-541-3p+pcDNA-SPOCD1组。

1.2.3 RT-qPCR检测miR-541-3p和SPOCD1 mRNA表达水平 提取细胞总RNA，反转录成cDNA后进行PCR，每个样品设3个复孔，反应条件为95℃3 min，95℃15 s，60℃30 s，72℃30 s，共40个循环；相对表达量用2-ΔΔCt计算。miR-541-3p和SPOCD1分别以U6和β-actin为内参，miR-541-3p上游引物序列：5'-GCGGATCCAGTTTCCAGAACACCCAGAT-3'，下游引物序列：5'-GCAAGCTTAAAAAACGACAAGCACGTCATAGA-3'；U6上游引物序列：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAA-3'，下游引物序列：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。SPOCD1上游引物序列：5'-CTCCCCAAGTTGCTGACCTG-3'，下游引物序列：5'-CCCCTGTAGCGGGCAAATATC-3'；βactin上游引物序列：5'-TTACTGCCCTGGCTCCTA-3'，下游引物序列：5'-ACTCATCGTACTCCTGCTTG-3'。

1.2.4 Western blot检测SPOCD1、CyclinD1、MMP2、MMP9和β-catenin蛋白表达水平 培养48 h后的各组细胞提取总蛋白，BCA试剂盒对蛋白进行定量。通过SDS-PAGE电泳将蛋白转至PVDF膜，封闭液封闭1 h后加入一抗（1∶1 000），4℃孵育过夜，Tris盐吐温缓冲液（Tris buffer solution tween，TBST）洗膜，加入二抗（1∶2 000）室温孵育90 min，TBST洗涤3次，ECL发光液显影，ChemiDoc XRS+系统成像，Quantity One软件测定蛋白条带灰度值，蛋白相对表达水平即为目的条带和β-actin条带比值。

1.2.5 MTT检测细胞存活率 取培养48 h的细胞加入MTT溶液，37℃孵育4 h，加入150μl DMSO，490 nm处用酶标仪检测各孔吸光度（OD）值。细胞存活率（%）即为实验组OD值和空白对照组OD值比值。实验重复3次，每次3个复孔。

1.2.6 Transwell检测细胞迁移和侵袭 细胞迁移实验：Transwell小室上室和下室中分别加入200μl细胞悬液和500μl RPMI1640培养液，培养48 h后先用4%多聚甲醛固定再用0.1%结晶紫染色，最后在显微镜观察并拍照，结晶紫染色细胞数即为迁移细胞数。细胞侵袭实验：先用Matrigel包被Transwell小室的上室，然后按照细胞迁移实验进行。

1.2.7 荧光素酶报告基因检测实验检测miR-541-3p对SPOCD1的靶向调控 构建含有miR-541-3p结合位点的SPOCD1-3′UTR野生型及突变型报告基因载体，在MCF-7细胞中转染miR-541-3p mimics、野生型及突变型报告基因载体。按照说明书检测荧光素酶活性，实验重复3次。

1.3 统计学分析 用SPSS20.0软件进行统计学分析。计量资料以±s表示，两组比较行t检验，多组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

图1 Western blot检测SPOCD1蛋白表达Fig.1 Western blot detection of SPOCD1 protein expression

2.1 在乳腺癌细胞系中miR-541-3p和SPOCD1的表达 与正常乳腺上皮细胞MCF-10A相比，乳腺癌细胞MCF-7、T47D、Bcap-37中miR-541-3p表达水平降低，SPOCD1 mRNA和蛋白表达水平升高（P＜0.05）（图1、表1）。

2.2 过表达miR-541-3p抑制乳腺癌细胞MCF-7增殖、迁移和侵袭 与miR-con组相比，miR-541-3p组乳腺癌细胞MCF-7中miR-541-3p表达水平显著升高，CyclinD1、MMP2、MMP9表达水平显著降低，细胞存活率显著降低，细胞迁移和侵袭数量显著降低（P＜0.05，图2、表2）。过表达miR-541-3p抑制乳腺癌细胞MCF-7增殖、迁移和侵袭。

2.3 敲减SPOCD1抑制乳腺癌细胞MCF-7增殖、迁移和侵袭 与si-con组相比，si-SPOCD1组乳腺癌细胞MCF-7中SPOCD1表达水平显著降低，CyclinD1、MMP2、MMP9表达水平显著降低，细胞存活率显著降低，细胞迁移和侵袭数量显著降低（P＜0.05，表3、图3）。可见敲减SPOCD1抑制乳腺癌细胞MCF-7增殖、迁移和侵袭。

表1 乳腺癌细胞和正常乳腺上皮细胞中miR-541-3p、SPOCD1 mRNA和SPOCD1蛋白表达量（±s，n=9）Tab.1 Expressions of miR-541-3p，SPOCD1 mRNA and SPOCD1 protein in breast cancer cells and normal breast epithelial cells（±s，n=9）

表1 乳腺癌细胞和正常乳腺上皮细胞中miR-541-3p、SPOCD1 mRNA和SPOCD1蛋白表达量（±s，n=9）Tab.1 Expressions of miR-541-3p，SPOCD1 mRNA and SPOCD1 protein in breast cancer cells and normal breast epithelial cells（±s，n=9）

Note：Compared with MCF-10A，1）P＜0.05.

SPOCD1 protein 0.20±0.03 1.12±0.121）0.95±0.101）0.88±0.091）Groups miR-541-3p MCF-10A MCF-7 T47D Bcap-37 1.00±0.12 0.35±0.031）0.40±0.041）0.45±0.051）SPOCD1 mRNA 1.00±0.15 2.01±0.201）1.86±0.191）1.75±0.181）

图2 过表达miR-541-3p抑制乳腺癌细胞MCF-7增殖、迁移和侵袭Fig.2 Overexpression of miR-541-3p inhibits proliferation，migration and invasion of breast cancer cell MCF-7

表2 过表达miR-541-3p抑制乳腺癌细胞MCF-7增殖、迁移和侵袭（±s，n=9）Tab.2 Overexpression of miR-541-3p inhibitsproliferation，migration and invasion of breast cancer cell MCF-7（±s，n=9）

表2 过表达miR-541-3p抑制乳腺癌细胞MCF-7增殖、迁移和侵袭（±s，n=9）Tab.2 Overexpression of miR-541-3p inhibitsproliferation，migration and invasion of breast cancer cell MCF-7（±s，n=9）

Note：Compared with miR-con，1）P＜0.05.

Number of invasivecells 157.68±15.76 159.63±16.05 92.38±9.251）Groups miR-541-3p CyclinD1 MMP2 MMP9 NC miR-con miR-541-3p 1.00±0.13 1.10±0.12 1.88±0.191）1.20±0.15 1.15±0.12 0.35±0.041）0.98±0.10 0.99±0.11 0.22±0.031）0.88±0.08 0.85±0.08 0.26±0.031）Cell survival rate（%）100.08±10.10 100.35±10.25 54.69±5.451）Number of migratory cells 386.96±38.70 388.53±38.86 183.05±18.321）

2.4 miR-541-3p靶向SPOCD1 Starbase预测SPOCD1与miR-541-3p存在结合位点（图4A）。荧光素酶报告实验结果（表4）显示，与miR-con组相比，miR-541-3p组转染野生型SPOCD1表达载体的细胞MCF-7的荧光素酶活性显著降低（P＜0.05）；而转染突变型SPOCD1表达载体的细胞MCF-7的荧光素酶活性差异无统计学意义。与miR-con组相比，miR-541-3p组SPOCD1表达水平显著降低；与antimiR-con组，相比anti-miR-541-3p组SPOCD1表达水平显著升高（P＜0.05）（图4，表5）。可见，miR-541-3p可靶向调控SPOCD1的表达。

2.5 高表达SPOCD1可以部分逆转miR-541-3p高表达对MCF-7增殖、迁移和侵袭的影响 与miRcon组相比，miR-541-3p组乳腺癌细胞MCF-7中SPOCD1表达水平显著降低，CyclinD1、MMP2、MMP9表达水平显著降低，细胞存活率显著降低，细胞迁移和侵袭数量显著降低（P＜0.05）；与miR-541-3p+pcDNA-con组相比，miR-541-3p+pcDNA-SPOCD1组乳腺癌细胞MCF-7中SPOCD1表达水平显著升高，CyclinD1、MMP2、MMP9表达水平显著升高，细胞存活率显著升高，细胞迁移和侵袭数量显著升高（P＜0.05，图5、表6）。高表达SPOCD1可以部分逆转miR-541-3p高表达对MCF-7增殖、迁移和侵袭的抑制作用。

表3 敲减SPOCD1抑制乳腺癌细胞MCF-7增殖、迁移和侵袭（±s，n=9）Tab.3 Knockdown of SPOCD1 inhibits proliferation，migration and invasion of breast cancer cells MCF-7（±s，n=9）

表3 敲减SPOCD1抑制乳腺癌细胞MCF-7增殖、迁移和侵袭（±s，n=9）Tab.3 Knockdown of SPOCD1 inhibits proliferation，migration and invasion of breast cancer cells MCF-7（±s，n=9）

Note：Compared with si-con，1）P＜0.05.

Number of invasivecells 158.96±15.86 155.76±15.89 80.46±8.051）Groups SPOCD1 CyclinD1 MMP2 MMP9 NC si-con si-SPOCD1 1.15±0.12 1.20±0.15 0.38±0.041）1.25±0.13 1.23±0.12 0.36±0.051）1.00±0.10 0.95±0.09 0.33±0.041）0.86±0.08 0.85±0.08 0.20±0.031）Cell survival rate（%）100.35±10.08 100.46±10.28 59.63±6.051）Number of migratory cells 388.32±38.86 384.38±38.45 176.35±17.651）

图3 Western blot检 测SPOCD1、CyclinD1、MMP2和MMP9的蛋白表达Fig.3 Western blot detection of protein expressions of SPOCD1，CyclinD1，MMP2 and MMP9

表4 miR-con或miR-541-3p与报告质粒共转染MCF-7细胞后双荧光素酶活性检测（±s，n=9）Tab.4 Detection of dual luciferase activity after miR-con or miR-541-3p co-transfection with reporter plasmid into MCF-7 cells（±s，n=9）

表4 miR-con或miR-541-3p与报告质粒共转染MCF-7细胞后双荧光素酶活性检测（±s，n=9）Tab.4 Detection of dual luciferase activity after miR-con or miR-541-3p co-transfection with reporter plasmid into MCF-7 cells（±s，n=9）

Note：Compared with miR-con，1）＜0.05.

Groups MUT 1.01±0.12 1.03±0.14 miR-con miR-541-3p luciferaseactivity WT 1.00±0.10 0.36±0.041）

图4 miR-541-3p靶向调控SPOCD1表达Fig.4 miR-541-3p targeted regulation of SPOCD1 expression

表5 Western blot检测SPOCD1的表达（±s，n=9）Tab.5 Western blotdetection of SPOCD1expression（±s，n=9）

表5 Western blot检测SPOCD1的表达（±s，n=9）Tab.5 Western blotdetection of SPOCD1expression（±s，n=9）

Note：Compared with miR-con，1）P＜0.05；compared with anti-miRcon，2）P＜0.05.

SPOCD1 1.21±0.13 0.36±0.041）1.18±0.12 1.56±0.162）Groups miR-con miR-541-3p anti-miR-con anti-miR-541-3p

图5 Western blot检 测SPOCD1、CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表达Fig.5 Western blot detection of SPOCD1，CyclinD1，MMP2 and MMP9 protein expression

图6 Western blot检测β-catenin蛋白表达Fig.6 Western blot detection ofβ-catenin protein expression

表6 高表达SPOCD1可部分逆转miR-541-3p高表达对MCF-7增殖、迁移和侵袭（±s，n=9）Tab.6 High expression of SPOCD1 can partially reverse high expression of miR-541-3p on proliferation，migration and invasion of MCF-7（±s，n=9）

表6 高表达SPOCD1可部分逆转miR-541-3p高表达对MCF-7增殖、迁移和侵袭（±s，n=9）Tab.6 High expression of SPOCD1 can partially reverse high expression of miR-541-3p on proliferation，migration and invasion of MCF-7（±s，n=9）

Note：Compared with miR-con，1）P＜0.05；compared with miR-541-3p+pcDNA-con，2）P＜0.05.

Number of invasive cells 160.38±16.05 90.38±9.081）91.35±9.15 121.37±12.152）Groups SPOCD1 CyclinD1 MMP2 MMP9 miR-con miR-541-3p miR-541-3p+pcDNA-con miR-541-3p+pcDNA-SPOCD1 1.20±0.12 0.32±0.041）0.35±0.05 1.05±0.112）1.18±0.14 0.33±0.041）0.34±0.07 0.96±0.102）1.01±0.10 0.30±0.051）0.32±0.04 0.88±0.092）0.86±0.09 0.22±0.041）0.24±0.05 0.70±0.082）Cell survival rate（%）100.22±10.20 53.75±5.381）52.68±5.27 86.34±9.002）Number of migratory cells 387.25±38.73 184.28±18.431）182.38±18.25 328.69±32.882）

表7 Western blot检测β-catenin蛋白表达（±s，n=9）Tab.7 Western blot detection ofβ-catenin protein expression（±s，n=9）

表7 Western blot检测β-catenin蛋白表达（±s，n=9）Tab.7 Western blot detection ofβ-catenin protein expression（±s，n=9）

Note：Compared with miR-con，1）P＜0.05；compared with miR-541-3p+pcDNA-con，2）P＜0.05.

β-catenin 1.10±0.11 0.40±0.041）0.45±0.05 0.92±0.092）Groups miR-con miR-541-3p miR-541-3p+pcDNA-con miR-541-3p+pcDNA-SPOCD1

2.6 Wnt/β-catenin通路相关蛋白的表达 与miRcon组相比，miR-541-3p组乳腺癌细胞MCF-7中βcatenin表达水平显著降低（P＜0.05）；与miR-541-3p+pcDNA-con组相比，miR-541-3p+pcDNA-SPOCD1组乳腺癌细胞MCF-7中β-catenin表达水平显著升高（P＜0.05，图6、表7）。可见，miR-541-3p过表达抑制Wnt/β-catenin通路的激活，而高表达SPOCD1可以部分逆转miR-541-3p高表达对Wnt/β-catenin通路的抑制作用。

3 讨论

分子靶向治疗已在乳腺癌中取得一定进展，并已成为乳腺癌的有效治疗手段之一［10］。miRNA是一种参与细胞各种生理过程的小RNA分子，也参与肿瘤的发展，并可作为肿瘤治疗的特异性靶点［11］。有研究报道miR-541在肝癌中低表达，过表达miR-541抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭，增加肝癌细胞株对索拉菲尼、阿霉素的敏感性［12］。还有研究发现lncRNA LOXL1-AS1通过调控miR-541-3p和CCND1影响前列腺癌细胞增殖和细胞周期进程［13］。本实验结果显示，在乳腺癌细胞中miR-541-3p表达水平显著降低，miR-541-3p过表达降低了细胞存活率和细胞迁移、侵袭数量，降低了CyclinD1、MMP2、MMP9表达水平。说明miR-541-3p过表达抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

SPOCD1与肿瘤相关，有研究发现SPOCD1在胶质瘤中高表达，与晚期肿瘤分级和预后不良有关，敲减SPOCD1可抑制胶质瘤U373和U87细胞的增殖、迁移和侵袭［14］。SPOCD1在骨肉瘤细胞系中上调表达，下调SPOCD1抑制了MG63和SAOS2骨肉瘤细胞集落的形成和增殖能力，且敲减SPOCD1促进细胞凋亡［15］。本实验结果显示，在乳腺癌细胞中SPOCD1表达水平显著升高，说明SPOCD1在乳腺癌中也高表达。且敲减SPOCD1降低了细胞存活率和细胞迁移、侵袭数量，降低了CyclinD1、MMP2、MMP9表达水平。说明敲减SPOCD1可抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。SPOCD1在乳腺癌中的作用与在胶质瘤和骨肉瘤中的作用相似，说明SPOCD1确实参与肿瘤的进展。且本实验还发现miR-541-3p靶向调控SPOCD1，SPOCD1高表达能部分逆转miR-541-3p高表达对细胞MCF-7增殖、迁移、侵袭的抑制作用。提示，miR-541-3p可能通过调控SPOCD1影响乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

研究发现异常活化的Wnt/β-catenin信号通路参与乳腺癌发生，其成员分子可作为miRNA的靶基因而受到调控，影响乳腺癌发生、发展［16］。β-catenin是Wnt/β-catenin信号通路的关键调控因子，βcatenin异常表达活化Wnt/β-catenin信号通路可促进乳腺癌淋巴细胞向肿瘤间质浸润［17］。抑制Wnt/β-catenin信号通路激活可抑制乳腺癌细胞的生长、迁移和侵袭［18］。还有研究报道miR-541-3p可能参与介导Wnt信号传导途径［19］。本实验结果显示，miR-541-3p过表达时β-catenin表达水平显著降低，说明miR-541-3p过表达抑制Wnt/β-catenin信号通路。SPOCD1高表达能部分逆转miR-541-3p高表达对Wnt/β-catenin信号通路的抑制作用。提示miR-541-3p可能通过调控SPOCD1影响Wnt/β-catenin信号通路进而影响乳腺癌细胞的进展。

综上所述，miR-541-3p过表达可抑制乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭，其机制可能与SPOCD1和Wnt/β-catenin信号通路相关，也将为乳腺癌的治疗提供新思路和新靶点。