miR-31对骨关节炎软骨细胞增殖、凋亡及炎症因子表达的影响

窦越超 张亚奎（首都医科大学附属北京潞河医院，北京101100）

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种慢性退行性关节疾病，表现为关节软骨结构和功能完整性的破坏以及炎症反应［1］。随着全球人口老龄化的加剧，OA发病率逐年上升，已成为世界范围内疼痛、残疾、缩短成人工作寿命的主要原因。目前尚无有效的防治方法，关节置换术是终末期OA的主要治疗方法。大量研究表明在OA进展过程中，过度的炎症反应与细胞凋亡相关，导致软骨细胞的减少和内稳态失衡［2］。因此，如何提高软骨细胞活力，抑制细胞凋亡，减轻炎症反应对OA防治意义重大。微小RNA（microRNA，miRNA）是一类较保守的短链非编码RNA，是细胞增殖、分化、炎症反应和凋亡等多种功能的关键调控因子，目前miR-195-5p、miR-206等多种miRNA已被证实参与OA的发生发展［3-4］。最近研究显示，OA患者关节软骨组织miR-31表达下调，然而其在OA进展中的作用并未完全阐明［5］。IL-34是近年来发现的一种新型炎症细胞因子，已有研究显示OA患者滑膜液中IL-34高表达与疾病的严重程度呈正相关，阻断IL-34功能可以减轻炎性关节炎的严重程度［6］。生物信息学分析显示IL-34是miR-31的潜在功能性靶基因，但miR-31能否靶向IL-34参与OA进展尚未可知。本研究通过IL-1β诱导软骨细胞构建OA细胞模型，探讨miR-31靶向IL-34在OA软骨细胞增殖、凋亡和炎症反应中的确切作用，以期为OA的防治提供新的理论依据［7］。

1 材料与方法

1.1 材料 健康SD大鼠购自南京君科生物工程有限公司；DMEM-F12培养基购自美国Hyclone公司；IL-1β购自美国Peprotech公司；TaKaRa反转录试剂盒和SYBR Premix Ex Taq购自大连宝生物工程有限公司；miRNA模拟物阴性对照（miR-NC）、miR-31模拟物（miR-31 mimics）、miRNA抑制物阴性对照（anti-miR-NC）、miR-31抑制物（anti-miR-31）、空载体（pcDNA3.1）、IL-34过表达载体（pcDNA3.1-IL-34）由上海吉玛制药有限公司提供；LipofectamineTM2000购自美国Invitrogen公司；MTT试剂、二甲基亚砜、RIPA裂解液、Annexin V-FITC/PI双染法细胞凋亡检测试剂盒北京索莱宝生物科技有限公司；兔源P21、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）、IL-34和磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体购自美国Abcam公司；TNF-α和IL-6 ELISA试剂盒购自上海生工生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养、模型构建和实验分组［7］于超净工作台内取正常大鼠双侧膝关节软骨，采用含青链霉素双抗的PBS液清洗，离心后弃去上清，用含20%胎牛血清的DMEM-F12培养基于37℃、含5%CO2培养箱中进行培养。将正常软骨细胞分为以下几组：对照组，正常培养的软骨细胞；模型组，用10 ng/L的IL-1β处理软骨细胞24 h；模型+miR-NC组，转染miR-NC 48 h后再用IL-1β诱导软骨细胞；模型+miR-31组，转染miR-31 mimics 48 h后再用IL-1β诱导软骨细胞。

为证实miR-31是通过调控IL-34表达进而影响OA软骨细胞的增殖、凋亡和炎症因子表达，将miR-31 mimics分别与pcDNA3.1、pcDNA3.1-IL-34共转染软骨细胞，再用IL-1β诱导24 h，依次记为模型+miR-31+pcDNA3.1组、模型+miR-31+pcDNA3.1-IL-34组。

1.2.2 RT-qPCR检测miR-31和IL-34 mRNA的表达 收集按照实验分组进行处理的各组细胞，Trizol法提取各组细胞总RNA，紫外分光光度计测定RNA浓度和纯度。利用TaKaRa反转录试剂盒将RNA逆转为cDNA，按照荧光定量试剂盒SYBR Premix Ex Taq说明书配置反应体系，利用2-ΔΔCt法分析miR-31和IL-34 mRNA的相对表达水平。miR-31正向引物5′-GCGGCGGAGGCAAGATGCTGGC-3′，反向引物5′-AGGCAAGATGCTGGCATAGCT-3′；IL-34正向引物5′-AATCCGTGTTGTCCCTCTTG-3′，反向引物5′-CAGCAGGAGCAGTACAGCAG-3′；GAPDH正向引物5′-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3′，反向引 物5′-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3′；U6正向引物5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′，反 向 引 物5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′。

1.2.3 MTT法检测细胞活力 将对数期软骨细胞接种到96孔板（5×103个/孔），按照实验分组进行细胞转染，然后采用10 ng/L的IL-1β处理软骨细胞24 h，每孔加入20μl的MTT溶液，孵育4 h后弃去上清液，每孔加入200μl的二甲基亚砜，振荡15 min至结晶完全溶解，以无细胞空白孔调零后，在490 nm波长处测定各孔的吸光度（OD）值。存活率=实验组OD/对照组OD×100%。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡 各组细胞按照实验分组进行干预后，收集各组细胞，PBS洗涤细胞后，采用适量结合缓冲液调整细胞密度的1×106个/ml的单细胞悬液。取100μl置于流式管内，分别加入5μl的Annexin V-FITC和5μl的PI，避光孵育15 min，加入400μl结合液缓冲液，混匀，立即采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.2.5 Western blot检测P21、Caspase-3和IL-34蛋白的表达 采用RIPA裂解液提取各组细胞总蛋白，BCA蛋白检测试剂盒进行定量。蛋白样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转到聚偏氟乙烯膜。用5%脱脂奶粉室温封闭膜1 h。洗膜后，加入一抗4℃孵育过夜，洗膜后，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG，洗膜后，加入化学发光试剂进行染色。利用Tanon 4200化学发光成像系统分析图像，以目的蛋白灰度值和GAPDH灰度值比值表示目的蛋白的表达水平。

1.2.6 ELISA法检测细胞上清液中TNF-α和IL-6的表达 各组细胞按照实验分组进行干预后，收集各组细胞上清液，按照TNF-α和IL-6检测试剂盒说明书进行操作，测定TNF-α和IL-6的表达水平。加样后，37℃温育30 min，洗涤5次后，加入50μl的酶标抗体，温育、洗涤后，加显色液显色，检测吸光度值并换算为TNF-α和IL-6的表达水平。

1.2.7 双荧光素酶报告基因实验验证miR-31对IL-34的靶向调控作用 构建含有miR-31结合位点的野生型（WT-IL-34）和含有miR-31结合位点突变序列的突变型（MUT-IL-34）荧光素酶报告基因载体由上海吉玛制药有限公司提供。利用LipofectamineTM2000将miR-NC、miR-31 mimics分别与WT-IL-34或MUT-IL-34共转染软骨细胞，经IL-1β诱导24 h，采用荧光素酶报告基因试剂盒检测各组细胞载体的荧光素酶活性。

1.3 统计学分析 采用SPSS18.0软件进行统计学分析，每组设置3个平行实验并重复3次，所有实验数据均采用±s表示。采用t检验进行两组间均数比较，多组间均数比较采用单因素方差分析，进一步组间两两比价采用SNK-q检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 炎症因子IL-34在OA软骨细胞的表达 见图1，相较于对照组，模型组软骨细胞中IL-34 mRNA的表达水平显著增加（P＜0.05）。

2.2 过表达miR-31对OA软骨细胞的细胞存活率凋亡的影响 见图2，与对照组比较，模型组软骨细胞P21和Caspase-3蛋白的表达显著升高，细胞存活率显著降低，细胞凋亡率显著升高；与模型+miR-NC组比较，模型+miR-31组软骨细胞P21和Caspase-3蛋白的表达显著降低，细胞存活率显著升高，细胞凋亡率显著降低（P＜0.05）。

2.3 过表达miR-31对OA软骨细胞中炎症因子表达的影响 见图3，与对照组比较，模型组软骨细胞中miR-31的表达显著降低，炎症因子TNF-α和IL-6表达显著升高；与模型+miR-NC组比较，模型+miR-31组软骨细胞中miR-31的表达显著升高，炎症因子TNF-α和IL-6表达显著降低（P＜0.05）。

图1 IL-34在OA软骨细胞中的表达Fig.1 Expression of IL-34 in OA chondrocytes

图2 过表达miR-31对OA软骨细胞的细胞增殖（A）凋亡（B、C）及P21、Caspase-3蛋白表达（D、E）的影响Fig.2 Effect of overexpressing miR-31 on cell proliferation（A）apoptosis（B，C）and P21，Caspase-3 protein expression（D，E）of OA chondrocytes

2.4 miR-31靶向、调控IL-34 采用targetscan进行靶基因预测显示，miR-31与IL-34的3'-UTR区域存在部分特异性结合的位点，见图4A。双荧光素酶报告基因实验显示，与miR-NC和WT-IL-34共转染组比较，miR-31和WT-IL-34共转染组软骨细胞的荧光素酶活性显著降低（P＜0.05）；与miR-NC和MUT-IL-34共转染组比较，miR-31和MUT-IL-34共转染组软骨细胞的荧光素酶活性无显著变化，见图4B。Western blot检测显示，与miR-NC组比较，miR-31组软骨细胞中IL-34在mRNA和蛋白水平的表达均显著降低；与anti-miR-NC组比较，anti-miR-31组软骨细胞中IL-34在mRNA和蛋白水平的表达均显著升高（P＜0.05），见图4C、D。说明miR-31靶向IL-34并负调控其表达。

2.5 过表达IL-34能逆转miR-31对OA软骨细胞的细胞存活和凋亡的影响 见图5，与模型组+miR-31+pcDNA3.1组比较，模型组+miR-31+pcDNA3.1-IL-34组软骨细胞IL-34、P21和Caspase-3蛋白的表达显著升高，细胞凋亡率显著升高，细胞存活率显著降低（P＜0.05）。

图3 过表达miR-31对OA软骨细胞中炎症因子表达的影响（±s，n=9）Fig.3 Effect of overexpressing miR-31 on expression of inflammatory factors in OA chondrocytes（±s，n=9）

图4 miR-31靶向调控IL-34Fig.4 miR-31 targeted regulation of IL-34

2.6 过表达I L-34能逆转miR-31对OA软骨细胞中炎症因子表达的影响 见图6，与模型+miR-31+pcDNA3.1组比较，模型+miR-31+pcDNA3.1-IL-34组软骨细胞TNF-α和IL-6的表达显著升高（P＜0.05）。

图5 过表达IL-34能逆转miR-31对OA软骨细胞增殖（A）、凋亡（B、C）及P21、Caspase-3蛋白表达（D、E）的影响Fig.5 Overexpression of IL-34 can reverse effect of miR-31 on OA chondrocyte proliferation（A），apoptosis（B，C）and P21，Caspase-3 protein expression（D，E）

图6 OA软骨细胞中炎症因子的表达Fig.6 Expression of inflammatory factors in OA chondrocytes

3 讨论

OA的发生是一个涉及多种因素的复杂过程，其中软骨细胞在OA的发病机制中起着非常重要的作用。因此，研究软骨细胞增殖、凋亡炎症反应的分子机制对寻找有效的OA治疗方法具有潜在的意义。

近年来，miRNA在OA中的作用备受关注，许多特异性的miRNA被证实在OA发病过程中起关键作用［8］。例如，miR-15a-5p通过靶向血管内皮细胞生长因子A来调节人OA软骨细胞的活力和基质降解［9］。miR-34a已被证实通过促进软骨细胞凋亡和衰老来促进OA的发展［10］。miR-31是肿瘤生物学中被广泛研究的miRNA之一，其调控模式和功能因肿瘤类型的不同而不同［11-12］。最近研究表明miR-31可促进软骨细胞增殖和迁移，但miR-31在OA中的作用并未完全阐明［13］。本研究显示IL-1β诱导的软骨细胞中miR-31的表达显著降低，与既往研究结论基本吻合。进一步功能分析显示，在IL-1β诱导条件下过表达miR-31可减少促凋亡蛋白Caspase-3和增殖抑制蛋白P21的水平，提高软骨细胞存活率，抑制细胞凋亡［14］。在OA发展过程中，大量细胞因子尤其是炎症因子参与调节和维持关节软骨的动态平衡，炎症因子的持续刺激促进软骨降解［15］。本研究中IL-1β诱导可显著提高软骨细胞中炎症因子TNF-α和IL-6的水平，而过表达miR-31则减轻IL-1β对软骨细胞炎症因子表达的促进作用。提示miR-31对OA软骨细胞具有保护作用。

IL-34是一种新型细胞因子，其通过与巨噬细胞集落刺激因子受体结合，调控单核吞噬细胞系细胞分化、增殖和存活［16］。先前研究显示血清和滑膜液中IL-34水平的升高与膝OA患者的放射学和症状严重程度显著相关［17］。在类风湿关节炎患者血清IL-34也呈高表达，IL-34可能在类风湿关节炎患者骨质疏松的发生发展中扮演着重要作用［18］。此外，有报道称赤雹根总皂苷通过抑制血液和滑膜组织中IL-34的表达可能对Ⅱ型胶原诱导性关节炎具有治疗作用［19］。本研究显示IL-1β诱导的软骨细胞中IL-34 mRNA的表达显著升高，与miR-31表达模式呈负相关关系。本研究显示过表达miR-31可降低IL-34-3'UTR报告基因荧光素酶活性，且在软骨细胞中负调控IL-34表达，与既往研究结论相吻合［20］。此外，本研究发现过表达IL-34还可逆转miR-31对IL-1β诱导的软骨细胞存活、凋亡以及TNF-α和IL-6表达的影响。提示miR-31通过靶向IL-34具有促进OA软骨细胞存活，抑制细胞凋亡，减轻炎症损伤作用。

综上所述，miR-31通过靶向IL-34可促进OA软骨细胞增殖，抑制细胞凋亡和炎症因子分泌。因此，miR-31和IL-34有望成为OA治疗的潜在靶点。