山药多糖对LPS诱导的心肌H9C2细胞炎症因子表达和细胞凋亡的影响及机制

邢 若 王 鹏 李兴杰

（首都医科大学附属世纪坛医院药剂科，临床合理用药生物特征谱学评价北京市重点实验室，北京100038）

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革兰氏阴性菌的致病部分，其侵入机体后，可以诱导组织炎症、氧化应激，造成组织损伤，最终诱导疾病发生［1］。LPS诱导的心肌细胞损伤是常见的心血管系统疾病如脓毒症心肌损伤发生机制之一［2］。LPS刺激后的心肌细胞凋亡水平增加、炎症因子释放水平增加、氧化应激水平升高［3］。山药多糖提取自山药，具有抗衰老、增加免疫力、抗氧化、降血糖等功效［4］。研究显示，山药多糖有改善心血管系统疾病的功效［5］。NF-κB是在人体内发挥多种生物学作用的调控因子，其激活后能够诱导炎症、氧化应激、细胞凋亡发生［6］。LPS刺激后的心肌细胞中NF-κB激活水平升高，并且下调NF-κB激活水平可以抑制心肌细胞损伤［7］。现阶段山药多糖在LPS诱导的心肌细胞损伤中的作用还不明确。本实验以心肌H9C2细胞作为体外实验对象，探讨山药多糖对LPS诱导心肌细胞炎症因子表达、细胞凋亡和氧化应激的影响和机制，为山药多糖治疗心肌损伤的应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料 心肌H9C2细胞购自通派（上海）生物科技有限公司；ROS检测试剂盒、LDH检测试剂盒、SOD检测试剂盒、MDA检测试剂盒购自北京普利莱基因技术有限公司；TNF-α含量检测试剂盒、IL-6含量检测试剂盒购自艾美捷科技有限公司；C-Caspase-3抗体、IκBα抗体购自美国Proteintech公司；p65抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；山药多糖（纯度：UV≥90%，SC9990-20 mg）购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8法测定山药多糖对心肌细胞增殖活性影响 将心肌细胞接种至96孔板中，每孔3 000个细胞。细胞贴壁以后，更换为含有山药多糖终浓度为0、0.05、0.10、0.20、0.40、0.80 g/L的细胞培养液培养，置于CO2培养箱内37℃孵育培养24 h后，将培养板取出，添加10μl的CCK-8，继续培养2 h，检测570 nm的OD值，以OD值表示细胞增殖活性。

1.2.2 细胞分组 心肌细胞分成Control、LPS、CYPS-L、CYPS-M、CYPS-H组，LPS、CYPS-L、CYPSM、CYPS-H组细胞分别以含有25 mg/L的LPS细胞培养液培养，CYPS-L、CYPS-M、CYPS-H组细胞分别在细胞培养液中添加终浓度为0.05、0.10、0.20 g/L的山药多糖。Control组为空白对照细胞。以CCK-8法测定Control、LPS、CYPS-L、CYPS-M、CYPS-H组细胞培养24 h后细胞增殖活性变化。

1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡 收集培养24 h后的Control、LPS、CYPS-L、CYPS-M、CYPS-H组细胞，用冰预冷以后的PBS溶液洗涤2次，然后在细胞内添加300μl的结合缓冲溶液，添加Annexin VFITC和PI染色液各5μl，避光反应15 min，上流式细胞仪检测凋亡变化。

1.2.4 ROS、SOD、MDA、LDH水平检测 收集培养24 h后的Control、LPS、CYPS-L、CYPS-M、CYPS-H组细胞和培养液上清，分别使用ROS检测试剂盒（荧光法）、SOD检测试剂盒（黄嘌呤氧化法）、MDA检测试剂盒（硫代巴比妥酸法）测定细胞中ROS、SOD、MDA水平，ROS结果以相对荧光表示，用LDH检测试剂盒（二硝基苯肼法）测定培养液上清中LDH水平，步骤均同试剂盒说明书。

1.2.5 ELISA法检测TNF-α、IL-6水平 收集培养24 h后的Control、LPS、CYPS-L、CYPS-M、CYPS-H组细胞培养液上清，以TNF-α含量检测试剂盒（ELISA法）、IL-6含量检测试剂盒（ELISA法）测定TNF-α、IL-6水平，步骤同说明书。

1.2.6 Western blot检测C-Caspase-3、p65、IκBα蛋白表达 收集培养24 h后的Control、LPS、CYPS-L、CYPS-M、CYPS-H组细胞，用1 ml的PBS洗涤细胞2次，然后添加RIPA裂解试剂，冰上裂解30 min，将裂解液转移到离心管内，12 000 g、4℃离心20 min，放在-80℃保存。以BCA法测定蛋白浓度。制备SDS-PAGE凝胶，每个孔内添加20μg蛋白样品，蛋白样品在添加到上样孔之前需要与等体积的2×Loading Buffer混合煮沸5 min。100 V电压电泳，观察溴酚蓝进入到上层胶和下层胶之间时，调整电压为120 V继续电泳。设置100 V的电压转膜90 min。取出电转后的PVDF膜，放在封闭液（5%牛血清白蛋白）内孵育1.5 h，然后将PVDF膜放在一抗（CCaspase-3抗体按照1：800稀释，p65抗体按照1∶1 000稀释，IκBα抗体按照1∶1 000稀释）中，在4℃结合过夜，然后放在二抗（二抗按照1∶4 000稀释）中，在室温孵育1.5 h。ECL发光后，分析目的条带和内参GAPDH的灰度值，以GAPDH作为内参，分析目的蛋白表达变化。

1.2.7 NF-κB信号激活剂对山药多糖影响心肌细胞凋亡、氧化应激以及炎症因子表达的作用 检测心肌细胞以含有25 mg/L的LPS、0.10 g/L的山药多糖、1μmol/L的NF-κB信号激活剂PMA处理，记为CYPS-M+PMA组，以CYPS-M组作为参照，利用上述1.2.1～1.2.7中方法检测细胞增殖、凋亡和ROS、SOD、MDA、LDH、TNF-α、IL-6水平及C-Caspase-3、p65、IκBα蛋白表达水平。

1.3 统计学分析 用SPSS21.0软件分析数据，数据以±s表示，两组数据间比较用t检验，多组差异比较用单因素方差，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 山药多糖对心肌细胞增殖活性影响 与0 g/L山药多糖处理相比，0.05、0.10、0.2 g/L的山药多糖处理后的心肌细胞增殖活性无显著性差异，0.40、0.80 g/L的山药多糖处理后的心肌细胞增殖活性降低（表1）。因此，选择0.05、0.10、0.20 g/L的山药多糖处理心肌细胞。

2.2 山药多糖对LPS诱导的心肌细胞凋亡影响与Control组比较，LPS组心肌细胞增殖活性降低，凋亡率升高，细胞中C-Caspase-3蛋白表达水平也升高。与LPS组比较，CYPS-L、CYPS-M、CYPS-H组心肌细胞增殖活性依次升高，凋亡率依次降低，细胞中C-Caspase-3蛋白表达水平依次降低（图1、表2）。山药多糖抑制LPS条件下心肌细胞凋亡。

2.3 山药多糖对LPS诱导的心肌细胞氧化应激影响 与Control组比较，LPS组心肌细胞中ROS和MDA水平升高，SOD水平降低，培养液上清中LDH水平升高。与LPS组比较，CYPS-L、CYPS-M、CYPS-H组心肌细胞中ROS和MDA水平依次降低，SOD水平依次升高，培养液上清中LDH水平依次降低（表3）。山药多糖抑制LPS条件下心肌细胞氧化应激。

表1 山药多糖对心肌细胞增殖活性影响（±s）Tab.1 Effects of Yam polysaccharide on proliferation activity of cardiomyocytes（±s）

表1 山药多糖对心肌细胞增殖活性影响（±s）Tab.1 Effects of Yam polysaccharide on proliferation activity of cardiomyocytes（±s）

Note：Compared with 0 g/L，1）P＜0.05.

Proliferative activity（OD570 nm）0.51±0.06 0.53±0.05 0.50±0.04 0.52±0.06 0.41±0.031）0.35±0.041）20.870＜0.001 Concentration（g/L）0 0.05 0.10 0.20 0.40 0.80 F P

2.4 山药多糖对LPS诱导的心肌细胞炎症因子表达影响 与Control组比较，LPS组心肌细胞培养液上清中TNF-α、IL-6水平升高。与LPS组比较，CYPS-L、CYPS-M、CYPS-H组心肌细胞培养液上清中TNF-α、IL-6水平依次降低（表4）。提示山药多糖抑制LPS条件下心肌细胞炎症因子表达。

图1 山药多糖对LPS诱导的心肌细胞凋亡和C-Caspase-3蛋白表达影响Fig.1 Effects of Yam polysaccharideon LPSinduced apoptosis and C-Caspase-3 protein expression in cardiomyocytes

表2 山药多糖对LPS条件下心肌细胞增殖活性、凋亡率和C-Caspase-3蛋白水平影响（±s）Tab.2 Effects of Yam polysaccharide on proliferation activity，apoptosis rate and C-Caspase-3 protein level of cardiomyocytesunder LPScondition（±s）

表2 山药多糖对LPS条件下心肌细胞增殖活性、凋亡率和C-Caspase-3蛋白水平影响（±s）Tab.2 Effects of Yam polysaccharide on proliferation activity，apoptosis rate and C-Caspase-3 protein level of cardiomyocytesunder LPScondition（±s）

Note：Compared with Control，1）P＜0.05；compared with LPS，2）P＜0.05；compared with CYPS-L，3）P＜0.05；compared with CYPSM，4）P＜0.05.

C-Caspase-3 protein（%）0.22±0.03 0.85±0.091）0.63±0.052）0.45±0.042）3）0.27±0.032）3）4）218.507＜0.001 Groups Control LPS CYPS-L CYPS-M CYPS-H F P Proliferative activity（OD570 nm）0.53±0.07 0.28±0.031）0.35±0.032）0.43±0.042）3）0.52±0.052）3）4）48.625＜0.001 Apoptosis rate（%）6.32±0.51 36.75±4.111）25.01±2.362）12.47±1.142）3）9.33±0.852）3）4）292.287＜0.001

2.5 山药多糖对LPS诱导的心肌细胞中NF-κB信号通路激活水平影响 与Control组比较，LPS组心肌细胞中p65蛋白水平升高，IκBα蛋白水平降低；与LPS组比较，CYPS-L、CYPS-M、CYPS-H组心肌细胞中p65蛋白水平依次降低，IκBα蛋白水平依次升高（图2、表5）。山药多糖抑制LPS条件下心肌细胞中NF-κB信号通路激活。

2.6 NF-κB信号激活剂对山药多糖影响LPS条件下心肌细胞凋亡、氧化应激和炎症因子表达作用 与CYPS-M组比较，CYPS-M+PMA组心肌细胞增殖活性降低，凋亡率和C-Caspase-3蛋白表达水平升高，细胞中ROS、MDA水平升高，SOD水平降低，培养液上清中LDH、TNF-α、IL-6水平升高，p65蛋白表达水平升高，IκBα蛋白表达水平下降（图3、表6）。

表3 山药多糖对LPS条件下心肌细胞ROS、SOD、MDA水平和培养液上清中LDH水平的影响（±s）Tab.3 Effects of Yam polysaccharide on ROS，SOD，MDA levels and LDH level in supernatant of cultured cardiomyocytes under LPScondition（±s）

表3 山药多糖对LPS条件下心肌细胞ROS、SOD、MDA水平和培养液上清中LDH水平的影响（±s）Tab.3 Effects of Yam polysaccharide on ROS，SOD，MDA levels and LDH level in supernatant of cultured cardiomyocytes under LPScondition（±s）

Note：Compared with Control，1）P＜0.05；compared with LPS，2）P＜0.05；compared with CYPS-L，3）P＜0.05；compared with CYPS-M，4）P＜0.05.

LDH（U/L）5.23±0.51 32.47±3.301）23.32±2.152）15.02±1.452）3）7.84±0.722）3）4）309.100＜0.001 Groups Control LPS CYPS-L CYPS-M CYPS-H F P ROS 1.00±0.09 4.69±0.511）3.26±0.122）2.04±0.202）3）1.45±0.112）3）4）300.395＜0.001 MDA（nmol/mg）9.55±0.74 31.45±2.681）21.28±2.062）16.34±1.422）3）10.20±1.012）3）4）244.621＜0.001 SOD（U/mg）86.79±8.51 39.50±4.221）48.62±3.562）62.30±4.812）3）76.08±6.572）3）4）99.466＜0.001

表4 山药多糖对LPS条件下心肌细胞培养液上清中TNFα、IL-6水平的影响（±s，ng/L）Tab.4 Effects of Yam polysaccharide on TNF-αand IL-6 levels in supernatant of cardiomyocyte culture medium under LPScondition（±s，ng/L）

表4 山药多糖对LPS条件下心肌细胞培养液上清中TNFα、IL-6水平的影响（±s，ng/L）Tab.4 Effects of Yam polysaccharide on TNF-αand IL-6 levels in supernatant of cardiomyocyte culture medium under LPScondition（±s，ng/L）

Note：Compared with Control，1）P＜0.05；compared with LPS，2）P＜0.05；compared with CYPS-L，3）P＜0.05；compared with CYPSM，4）P＜0.05.

IL-6 36.52±3.71 327.94±20.841）264.89±22.852）186.76±18.422）3）104.55±10.282）3）4）439.868＜0.001 Groups Control LPS CYPS-L CYPS-M CYPS-H F P TNF-α 22.81±2.01 217.89±16.351）163.74±12.582）104.95±10.222）3）43.78±3.262）3）4）548.128＜0.001

图2 山药多糖对LPS条件下心肌细胞中p65、IκBα蛋白表达的影响Fig.2 Effect of Yam polysaccharide on p65 and IκBαprotein expression in cardiomyocytes under LPScondition

表5 山药多糖对LPS条件下心肌细胞p65、IκBα蛋白表达水平的影响（±s）Tab.5 Effects of yam polysaccharide on p65 and IκBα protein expression in cardiomyocytes under LPS condition（±s）

表5 山药多糖对LPS条件下心肌细胞p65、IκBα蛋白表达水平的影响（±s）Tab.5 Effects of yam polysaccharide on p65 and IκBα protein expression in cardiomyocytes under LPS condition（±s）

Note：Compared with Control，1）P＜0.05；compared with LPS，2）P＜0.05；compared with CYPS-L，3）P＜0.05；compared with CYPSM，4）P＜0.05.

IκBα 1.03±0.11 0.23±0.041）0.43±0.062）0.68±0.072）3）1.06±0.102）3）4）185.772＜0.001 Groups Control LPS CYPS-L CYPS-M CYPS-H F P p65 0.20±0.03 0.96±0.111）0.65±0.062）0.41±0.042）3）0.21±0.022）3）4）251.202＜0.001

图3 NF-κB激活剂和山药多糖对LPS条件下心肌细胞中p65、IκBα、C-Caspase-3蛋白表达影响Fig.3 Effects of NF-κB activator and yam polysaccharide on p65，IκBαand C-Caspase-3 protein expression in cardiomyocytes under LPScondition

表6 NF-κB激活剂和山药多糖对LPS条件下心肌细胞增殖活性、凋亡率和细胞中ROS、SOD、MDA水平和培养液上清中LDH、TNF-α、IL-6水平以及p65、IκBα、C-Caspase-3蛋白表达水平影响（±s）Tab.6 Effects of NF-κB activator and yam polysaccharide on proliferation activity，apoptosis rate，ROS，SOD，MDA levels in cardiomyocytes，LDH，TNF-α，IL-6 levels in culture medium supernatant and p65，IκBα，C-Caspase-3 protein expression levels in LPStreated cardiomyocytes（±s）

表6 NF-κB激活剂和山药多糖对LPS条件下心肌细胞增殖活性、凋亡率和细胞中ROS、SOD、MDA水平和培养液上清中LDH、TNF-α、IL-6水平以及p65、IκBα、C-Caspase-3蛋白表达水平影响（±s）Tab.6 Effects of NF-κB activator and yam polysaccharide on proliferation activity，apoptosis rate，ROS，SOD，MDA levels in cardiomyocytes，LDH，TNF-α，IL-6 levels in culture medium supernatant and p65，IκBα，C-Caspase-3 protein expression levels in LPStreated cardiomyocytes（±s）

Note：Compared with CYPS-M，1）P＜0.05.

Groups Proliferative activity（OD570 nm）Apoptosisrate（%）C-Caspase-3 ROS MDA（nmol/mg）SOD（U/mg）LDH（U/L）TNF-α（ng/L）IL-6（ng/L）p65 IκBα CYPS-M CYPS-M+PMA 0.44±0.05 11.58±1.23 0.49±0.05 1.00±0.08 15.95±1.36 61.84±5.30 14.78±1.27 102.98±10.41 187.93±14.45 0.38±0.05 0.63±0.06 t P 0.30±0.041）6.559＜0.001 18.65±1.751）9.916＜0.001 0.87±0.061）14.596＜0.001 1.69±0.121）14.353＜0.001 24.01±0.201）17.590＜0.001 46.21±3.371）7.466＜0.001 25.75±2.361）12.280＜0.001 185.72±16.651）12.641＜0.001 236.20±20.591）5.575＜0.001 0.75±0.071）12.903＜0.001 0.35±0.051）10.755＜0.001

3 讨论

山药又称为薯蓣，具有补肾、健脾、生津等作用，其既是一味中药，又是一种食物［8］。山药多糖是山药中的主要活性成分，其由葡萄糖、甘露醇、半乳糖、阿拉伯糖、木糖等组成，具有降低血糖、调节免疫、抗肿瘤、清除氧自由基等药理学功能［9］。有研究发现，山药多糖治疗后的心肌梗死大鼠心肌细胞凋亡水平降低，山药多糖降低脑缺血再灌注大鼠脑组织氧化应激和炎症因子释放水平［5，10］。本实验显示，山药多糖处理后的LPS条件下心肌细胞增殖活性升高，细胞凋亡率降低，提示山药多糖抑制LPS诱导的心肌细胞凋亡，山药多糖具有保护心肌细胞损伤的作用。

研究显示，LPS诱导心肌细胞炎症和氧化应激等是其造成心肌细胞损伤的重要机制［11］。LPS刺激以后的心肌细胞中产生大量的ROS，ROS不能被SOD等抗氧化酶及时降解，导致ROS聚集在心肌细胞内，ROS不仅能够激活Caspase凋亡反应，诱导细胞凋亡发生，还可以将细胞内的脂质过氧化，造成氧化损伤［12-13］。MDA是脂质过氧化的产物，也是氧化损伤的标志［14］。脂质是细胞膜的主要成分之一，其过氧化后造成细胞膜损伤，促使细胞内的LDH进入细胞外，因此，检测培养液上清中LDH水平可以间接反映细胞损伤程度［15］。Caspase-3位于Caspase级联反应的下游，其活化后被认为是细胞凋亡的标志［16］。LPS刺激诱导心肌细胞产生大量的TNF-α、IL-6等炎症因子，这些炎症因子也能够诱导细胞凋亡发生，加重细胞损伤［17-19］。另外，过量的炎症反应也可以促进细胞内ROS积累［20］。本次实验结果显示，山药多糖处理后的LSP条件下心肌细胞中ROS、MDA水平降低，SOD水平升高，培养液上清中LDH、TNF-α、IL-6水平降低，C-Caspase-3蛋白表达水平下降，提示山药多糖减少心肌细胞释放炎症因子，减少氧化损伤。

本课题组还进一步探讨了山药多糖的作用机制，发现山药多糖能够降低LPS条件下心肌细胞中p65表达水平，提高IκBα表达水平。p65是NF-κB信号的关键亚单位，其表达水平高低与NF-κB信号激活水平正相关，NF-κB激活水平与氧化应激、炎症等有关［21］。IκBα是NF-κB信号的重要组成部分，其表达升高后NF-κB激活水平下调［22］。研究显示，LPS刺激以后的心肌细胞中NF-κB信号激活水平升高，并且抑制NF-κB信号可以降低LPS诱导的心肌细胞损伤［7，23］。本实验以NF-κB信号激活剂处理心肌细胞，结果发现，NF-κB信号激活剂可以逆转山药多糖对LPS诱导的心肌细胞增殖、凋亡、炎症因子释放以及氧化应激相关指标的影响，说明山药多糖作用机制与NF-κB信号有关。

综上，山药多糖有改善LPS诱导心肌损伤的作用，其可以抑制细胞凋亡、氧化应激和炎症因子表达，机制与抑制NF-κB信号密切相关。本课题组会继续深入探讨山药多糖通过何种靶向机制影响NFκB信号进而调控细胞凋亡、氧化应激和炎症因子表达。本实验结果为山药多糖治疗心肌损伤的应用提供了理论资料，为研究山药多糖在心血管系统疾病中的作用和机制奠定了基础。