无花果多糖分析方法的建立

朱俊珺

（安徽省蔬菜质量检测中心 安徽，马鞍山 238200)

1 引言

无花果富有药用医疗价值，尤其多糖作为一类重要的生物反应调节剂，在抗肿瘤、抗衰老和免疫调节等方面具有良好的应用前景[1]。无花果多糖作为一种免疫功能调节剂引起广泛的重视。

由于多糖的多样性，关于多糖的定量测定到目前为止，并没有一个统一的标准方法[2]。利用苯酚-硫酸试剂进行显色反应，并在490nm处有最大吸收，吸收值与糖含量呈线性关系。此法简单、快速、灵敏，颜色持久。但对于杂多糖，分析结果可能误差较大。因此，本文根据无花果多糖中单糖的组成，结合主要组分单糖的标准曲线计算校正系数，来改进传统的苯酚-硫酸显色测定。

2 无花果多糖测定实验

2.1 实验材料

2.1.1 原料 无花果粉（粉碎过20目筛），烘干备用。

2.1.2 主要试剂 石油醚（60℃-90℃）、95%乙醇、苯酚；来自上海化学试剂。

浓硫酸、葡萄糖、D-半乳糖、D-木糖、D-甘露糖；来自国药集团。

L-树胶醛糖、L-鼠李糖；来自沃凯试剂。

2.1.3 主要仪器和设备（见表1）

2.2 无花果多糖的提取

2.2.1 无花果粗多糖的提取 压过果汁的无花果果渣在鼓风干燥箱中低温烘干后，机械粉碎，过20目筛，用天平准确称取一定量的粉末，在69℃下采用石油醚（1：5）溶剂回流法提取2小时，重复1次。残渣挥干石油醚，称重，按1：10 的比例加入蒸馏水，在100℃下采用蒸馏水（1：10）回流法提取3h，重复2 次。提取液合并浓缩后，多次加入95%乙醇生成沉淀，离心过滤直至无沉淀产生。收集沉淀，在40℃条件下烘干即得无花果粗多糖[3]。

2.2.2 无花果精多糖的提取 无花果粗多糖配制成水溶液后，超滤（收集分子量＞10kDa 部分），然后在60℃和0.095MPa 条件下以50r/min 进行真空浓缩，收集20mL 左右。再经搅拌缓慢加入无水乙醇，加入量大约四倍体积，4℃下静置12h，离心10min 左右。得到的沉淀物用20mL无水乙醇、丙酮以及乙醚依次洗涤2次，最后真空干燥至恒重，即得无花果精制多糖[4]。称重，计算得率，4℃保存备用。

2.3 无花果多糖中单糖组成的GC分析

2.3.1 样品制备 准确称取10.7mg 无花果精制多糖，加入3.0mL,2mol/L 的三氟乙酸，100℃水解8h，水解液于50℃蒸干。加入10.0mg盐酸羟胺、0.5mL吡啶，于90℃反应30min，并不时震荡。冷却至室温，加入0.5mL醋酸酐，90℃下乙酰化反应30min，最后进行气相色谱分析[5]。

分别准确称取一定量的半乳糖、鼠李糖、甘露糖、树胶醛糖、木糖和葡萄糖，加入盐酸羟胺，内标0.0099g，加入吡啶3mL、乙酸酐3mL，以同样方法进行处理[5]。

2.3.2 GC 分析 气相色谱HP5890，色谱柱HP-INNO-WAX 19091N-133；炉温210℃，进样口250℃，FID检测器温度250℃；载气为氮气；载气流速0.82mml/min，总流量34mLmin，分流比40：1[6]。结果见图1和图2。

表1 主要仪器和设备

根据图1和图2的对比结果可知，无花果多糖的构成主要有：鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖和葡萄糖，其中葡萄糖含量最高。因此本实验采用标准葡萄糖作为标准糖，用于无花果多糖的含量的测定。

图1 六个标准单糖GC分析

图2 无花果多糖中单糖含量的GC分析

2.4 苯酚—硫酸法检测无花果多糖

2.4.1 葡萄糖标准液的配制 准确称取0.1009g的标准葡萄糖(105℃干燥恒重)，蒸馏水定容l00mL，再稀释成10倍。

2.4.2 苯酚溶液的配制 处理苯酚：称取100g 苯酚(纯苯酚为针状无色结晶)，水浴加热后溶解，加铝片0.10g(先用1：6 的盐酸除去铝片表面的氧化铝后再称量使用)，加氢氧化钠0.05g，蒸馏收集182℃的馏分[7]。

80%苯酚：水：处理苯酚=1:4，避光冷藏保存。

6%苯酚：临用前以80%苯酚配制。

2.4.3 最大吸收波长的选择 精密吸取0.1mg/mL 的葡萄糖标准溶液1.0mL，置于10mL 具塞试管中，依次用1.0mL 蒸馏水和1.0mL 5%苯酚试液，摇匀，迅速滴加5.0mL 浓硫酸，摇匀后静置5min，沸水浴加热15min，取出后冷却至室温。同理，蒸馏水代替糖溶液配制空白。用分光光度计在450-550mn 范围内扫描，得出葡萄糖标准液的最大吸收波长在490nm处。

2.4.4 标准曲线的绘制 精密吸取浓度为0.1009 mg/mL的葡萄糖标准溶液0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20mL，分别置于15mL具塞试管中，依次添加：蒸馏水至2.0mL—1.0mL 6%苯酚溶液—5.0mL 浓硫酸。之后，摇匀静置10min，先沸水浴15min，后冷却至室温。用同样方法蒸馏水配制空白，于490nm 处测定吸光值。绘制葡萄糖质量一吸光度标准曲线，结果见图3。

图3 苯酚-硫酸法测定多糖含量的标准曲线

2.4.5 换算因子的测定 精密称取精制多糖2.2mg，蒸馏水定容100mL，摇匀，得样品溶液。按“2.4.4”的方法测定，并由图3中回归方程计算出葡萄糖的含量，按公式(1)得出换算因子如下[7]。

式（1）中：W 为称取的多糖质量（mg），C 为精制多糖液中葡萄糖的浓度（mg/mL），D为多糖液的稀释倍数。

取1 mL样品液，用同样的方法平行测定三次，取平均吸光度：A=0.1215。

代入回归方程：Y=7.3552X+0.0029 计算出葡萄糖的质量，再代入式（1），计算出换算因子为：f=1.375。

2.5 无花果多糖含量的测定

2.5.1 无花果提取液的准备 称取无花果粉1.0342g，20mL石油醚提取回流1h，滤渣用20 mL热石油醚洗涤2-3 次，沸水浴提取2h，趁热过滤，并蒸馏水定容100mL，摇匀备用。

2.5.2 无花果中多糖含量的测定 1mL 无花果提取液用蒸馏水定容250mL,作为待测液。按“2.4.4”的方法测定，代入式（2）计算样品中多糖的含量。

式（2）中：C 为样液中葡萄糖的浓度（mg/mL），D 为样液的稀释倍数，f为换算因子，W为相应的样品重量（g）。

取1mL待测液，按“2.4.4”的方法平行测定三次，得吸光度为：A=0.287。按上述公式计算无花果果渣中总多糖的含量为：12.8%。

2.5.3 重现性试验 精确称取无花果粉6 份各5mg 左右（精度d=0.1mg）。按“2.5.1”的方法测定无花果多糖的含量，代入式（2）计算。

取1mL 制得的样品溶液，按“2.4.4”的方法测其吸光度，每组平行测定3次，取其平均值，经计算结果见表2。

2.5.4 稳定性实验 准确吸取2mL 待测液，取于15mL具塞试管中，每隔30min测定一次，持续24h，考察其稳定性。实验结果见表3。

2.5.5 加样回收率的测定 准确称取6份无花果粉，各5 mg 左右（精度d=0.1mg），同时对应加入精制无花多糖，各10mg 左右。按“2.5.1”的方法制备得到样液，再按“2.4.4”的方法测得吸光度，计算回收率。结果见表4。

表2 无花果多糖测定重现性测定结果

表3 无花果多糖稳定性实验结果

表4 无花果多糖加样回收率实验结果

2.6 结果与讨论

无花果经过脱脂、脱蛋白质提取分离得到的多糖，用苯酚－硫酸法测定多糖的含量。根据单糖组分的GC 分析，用葡萄糖作为标准样，绘制标准曲线，测得无花果多糖的换算因子为f=1.375，测得无花果多糖的含量为12.8%。本法简单快速，显色稳定，灵敏度高，适合于检测柱层析收集样品中多糖的定量分析[7]。

比色反应中特别要注意分层现象[8]，一定要加入苯酚后充分摇匀，之后迅速加入硫酸，控制好比色反应的时间和温度，沸水浴后冷却要及时，这样重现性才高。

在多糖含量测定中通常选择单糖如葡萄糖代替为多糖对照品，系统误差较大。本实验中一方面经过脱脂，Sevage 法除蛋白，醇沉和超滤除去小分子杂质，最后有机溶剂脱色[9]，得到了精制的无花果多糖。另一方面根据单糖组分的GC 分析选择葡萄糖为标准品，计算出换算因子，来避免一些系统误差，获得比较准确的结果。