mir-335-5p在肺癌骨转移中的变化及意义①

王 明，张家玮，于 涛,魏 巍

(1．佳木斯大学附属第一医院骨外二科，黑龙江 佳木斯 154003；2.佳木斯市肿瘤结核医院乳腺外科，黑龙江 佳木斯 154007)

骨转移癌是指原发性恶性肿瘤向骨转移引起的骨破坏。晚期癌症的骨转移率一般在80%以上。癌细胞向骨转移时，常出现与运动系统、血液系统、内分泌系统有关的症状，如骨痛、病理性骨折等，将大大缩短骨转移患者的生存率。当前，确诊癌症是否骨转移的常规办法有：肿瘤标志物检查、放射线、核素骨扫描、磁共振等，但当上述检查出现改变时，往往意味着骨质已经破坏，同时敏感度与特异度较差，组织活检为金标准但取材困难，为有创检查，易造成肿瘤进一步扩散。由于确诊较晚，即使通过药物、射线、手术等相关治疗，预后仍然很差。近年来，miRNA被发现在人类生命活动中有着不可替代的作用，同时也是肿瘤增值、侵袭、转移的桥梁，本文旨在探讨mir-335-5p在外周血中的表达与肺癌及其骨转移的关系。

1 资料和方法

1.1 一般资料

选取2019-10～2020-01佳木斯市肿瘤结核医院收治的30例肺癌患者血样。骨转移组15例，平均年龄(59.33±11.61)岁，纳入标准：①均经过病理切片确诊；②均通过PET-CT或ECT确诊为骨转移。排除标准：①患有其他原发肿瘤；②患者本人不同意参加实验。原位癌组15例，平均年龄(62.33±12.58)岁，纳入标准：均经过病理切片确诊；排除标准：①患有其他原发肿瘤；②患者本人不同意参加实验。以及12例正常人血液样本。实验经我院伦理委员会批准，患者知情同意，两组受试者年龄无显著性差异。

1.2 全血mir-335-5p的检测

1.2.1 标本采集

采用含6%乙二胺四乙酸的一次性BD-Vacutainer1管静脉输注采集所有患者外周血样2mL。于抗凝管内混匀后将样本分为4份各250μL置于4个1.5mL无RNA酶离心管内，将分装后样本标记并置于-80℃低温保存。

1.2.2 实时荧光定量PCR检测miRNA-335-5P

Trizol法提取外周血中的miRNA，使用生工mirna反转录试剂盒(加尾法)将mirna合成cDNA。反应温度为：37°作用60min；85°作用5min。Q-PCR反应体系与程序按生工荧光定量PCR试剂盒(染料法)说明书推荐进行。mir-335-5p引物序列为：上游引物：5’-CGCGCTCAAGAGCAATAACGAAAAATG-3’,下游引物：为反转录试剂盒中下游通用引物(Universal PCR Primer R(10μL))。U6内参引物为反转录试剂盒中U6(Universal U6 Primer F(10μL))和下游通用引物(Universal PCR Primer R(10μL))。反应体系：2Xmirna qPCR master mix 10μL；上下游引物各0.5μL；cDNA 2μL；ROX Reference Dye(H)1μL；RNase-free water 6μL；应用7300 real time PCR进行检测。反应条件为：95°30s；(95°5s +60°30s)进行40个循环；溶解曲线以7300 real time PCR仪推荐的程序自动设定。每份样本均在同等条件下进行mir-335-5p的检测，每个样本进行2次重复。浓度相对水平进行对数( 2^-△△CT) 处理后，计算 miR - 335 - 5p 基因的起始模板量从而反映出mir-335-5p基因的浓度相对水平。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 外周血中miRNA-335-5p在正常人、肺癌原位癌、肺癌骨转移患者中的表达水平

骨转移组对数变化(0.69±0.17)较原发性肺癌组对数变化(0.42±0.19)减少，差异有统计学意义(P<0.01)。见图1。

图1 正常对照组、原位癌组、骨转移组之间的差异表达

2.2 ROC水平曲线分析

ROC曲线显示mir-335-5p能够明显的区分肺癌原位癌和骨转移癌。见图2。ROC曲线下面积AUC为：0.838,95%置信区间为(0.689～0.985)(P<0.01)。

图2 ROC水平曲线

2.3 mir-335-5p于肺癌骨转移患者临床相关性

mir-335-5p的表达在肺癌患者年龄(>60岁；≤60岁)，差异有统计学意义(P<0.05)；与患者化疗前和化疗后，差异有统计学意义(P<0.05)。与骨转移发生与否，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 mir-335-5p临床特性的统计学意义

3 讨论

MicroRNA是一类仅有21-25个核苷酸的小非编码RNA家族，它通过与靶mRNA的互补位点配对，抑制信使RNA(mRNA)的翻译，促进mRNA的降解[1]。MicroRNA与人类多种恶性肿瘤的生物学行为密切相关，在这些恶性肿瘤的发生、发展、侵袭和转移中起着关键的调控作用[2]。目前在肺癌及其骨转移中，以miRNA作为其诊断标志物的研究越来越广泛。肺癌骨转移中有两种类型的miRNA改变，上调的有：miR-660-5p、mir-203、mir-125b-5p、mir-125b-2-3p等。下调的有：miR-192-5p、mir-335-5p、miR-139-5p、mir-29c、mir-21-3p等。MiRNA-335-5p属于下调中的一员。mir-335-5p已被发现在多种恶性肿瘤中表达异常，例如：TGF-β1通过下调mir-335-5p的表达诱导NSCLC转移[3];在结直肠癌中，mir-335-5p可通过下调IDHB抑制细胞增殖、迁移和侵袭[4];MiR-335通过上调CRKL抑制膀胱癌细胞的增殖和迁移[5]；在骨肉瘤中DNACR可以通过miR-335-5p促进肿瘤生长的和肺转移[6]。除上述几种恶性肿瘤外，尚有多种恶性肿瘤与mir-335-5p的侵袭和转移密切相关，包括前列腺癌，子宫内膜癌、乳腺癌等。

目前，mir-335-5p在肺癌骨转移相关的研究较少。mir-335-5p在NSCLC中的表达显著降低。在体外，恢复mir-335-5p的表达可以削弱NSCLC的侵袭能力[7],随着疾病的发展，mir-335-5p 的表达持续下降，预后不良，总生存率降低；Mir-335-5p 在小细胞癌骨转移瘤患者中的表达明显下调。重建 mir-335-5p 的表达可显著抑制小细胞癌转移。

已有多项研究表明在肺癌中，组织(肿瘤组织、骨转移组织)、细胞(原位癌细胞、高转移细胞)、生物学预测都已证明，相比于正常人mir-335-5p的表达明显下调，并且随着肿瘤进一步发展直至发展到最终的骨转移，mir-335-5p会进一步降低。本实验结果表明mir-335-5p的表达水平的显著下调与肺癌从正常人到原位癌再到骨转移的疾病进展方向一致，mir-335-5p的表达在肺癌患者年龄差异有统计学意义；肺癌中mir-335-5p的表达在外周血、组织、细胞三者均随着疾病进展持续下降。mir-335-5p表达下调的机制需要进一步研究。

综上所述，Mir-335-5p可作为肺癌诊断和治疗及肺癌骨转移的研究热点，但本实验样本量小，mir-335-5p在肺癌进展为骨转移的进程中的潜在作用及其作为生物标志物的临床实用性有待进一步研究。