硒甲基硒代半胱氨酸对神经母细胞瘤细胞增殖及凋亡的影响

刘慧纯，王从平，刘群会，李文静，贾 敏

神经母细胞瘤(neuroblastoma，NB)起源于原始神经嵴细胞，是儿童最常见的颅外恶性实体肿瘤之一，其发病率在所有儿童恶性肿瘤中占6%～10%[1]。NB初发症状不典型，难以获得早期诊断，预后较差[2]。手术是NB的主要治疗方式，但目前单纯手术已不能满足治疗需要，大多数患儿还须给予辅助化疗，但其毒副作用大，容易产生耐受性，效果欠佳[3]。因此，寻找靶向性强、毒副作用小的化疗药物十分关键。硒甲基硒代半胱氨酸(Se-methylselenocysteine，MSC)是硒代半胱氨酸的甲基化衍生物，属于天然有机砷化物之一，具有补硒、抗氧化、抗衰老及治疗心脑血管等疾病的作用[4]。近期研究发现其对乳腺癌和肝癌等多种恶性肿瘤均有抑制作用，具有一定抗癌潜能[5-7]。但在NB中研究较少。本研究选取两种NB细胞株(SH-SY5Y和SK-N-DZ)进行体外培养，并用MSC进行干预，观察MSC对NB细胞增殖及凋亡的影响，并探讨其作用机制，为NB患儿新药研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料及仪器 人NB细胞株(SH-SY5Y和SK-N-DZ)均购自美国ATCC细胞库，DMEM培养基和胎牛血清均购自美国Gibico公司，CCK-8试剂盒购自日本Dojindo公司，PE-膜联蛋白-V(AnnexinV-PE)/7-氨基放线菌素-D(7-AAD)细胞凋亡检测试剂盒和细胞周期检测试剂盒购自美国BD公司，BCA蛋白提取试剂盒和BCA蛋白定量试剂盒购自美国Sigma公司，半胱氨酸蛋白酶(caspase)-3、caspase-8、caspase-9蛋白、β-actin单克隆抗体及辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记羊抗兔二抗均购自美国Abcam公司，ECL发光盒和聚偏二氟乙烯(PVDF)膜购自美国Millipore公司。Elx808 IU-PC酶标仪购自美国BioTek公司，FACS Calibur流式细胞仪购自美国BD公司，ChemiDoc MP凝胶成像仪购自美国BIO-RAD公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将人NB细胞株SH-SY5Y和SK-N-DZ种植于含10%胎牛血清DMEM培养基中(内含青霉素和链霉素各100 U/mL)，后将其置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，隔天换液，2～3 d传代1次。

1.2.2 CCK-8法检测细胞增殖 以4×103/孔将SH-SY5Y和SK-N-DZ细胞接种到96孔板中，培养24 h，待细胞贴壁后将不同浓度MSC(0 μmol/L、5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L和200 μmol/L，现配)处理细胞，每孔100 μL，另设空白孔和对照孔，每组设置3个复孔；将其置于培养箱继续培养24 h，后向每孔加入10 μL CCK-8溶液，充分混匀后于培养箱继续孵育3 h，用酶标仪测定490 nm处各孔A值，本试验重复3次；其中存活率=[(实验孔A值-空白孔A值)/(对照孔A值-空白孔A值)]×100%；半抑菌浓度(50% inhibitory concentration，IC50)值用GraphPad Prism7.0计算。

1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡 取对数生长期SH-SY5Y和SK-N-DZ细胞重悬，调整细胞密度至2×104/mL，将其接种于6孔板中，每孔2 mL，培养24 h，再用不同浓度MSC(5 μmol/L、25 μmol/L和50 μmol/L，现配)处理细胞，另设空白对照组；将其置于培养箱继续培养24 h后收集各组细胞，洗涤2次，后用500 μL Binding Buffer重悬细胞，并参考试剂盒说明书向其中加入Annexin V-PE 和7-AAD染液(各5 μL)，于冰上避光反应15 min，然后用流式细胞仪检测。

1.2.4 流式细胞术检测细胞周期 取各组对数生长期细胞重悬，调整细胞密度至2×104/mL，将其接种于6孔板中，每孔2 mL，培养24 h，后用不同浓度MSC(5 μmol/L、25 μmol/L和50 μmol/L，现配)处理细胞，另设空白对照组；将其置于培养箱继续培养24 h后收集各组细胞，洗涤2次，后用500 μL Binding Buffer重悬细胞，并参考试剂盒说明书向其中加入400 μL碘化丙锭(PI)染液，混匀，4 ℃避光反应30 min，用流式细胞仪检测。

1.2.5 蛋白免疫印迹(Western Blot)法检测凋亡相关蛋白表达 取各组对数生长期细胞重悬，调整细胞密度至2×104/mL，将其接种于6孔板中，每孔2 mL，培养24 h，后用不同浓度MSC(5 μmol/L、25 μmol/L和50 μmol/L，现配)处理细胞，另设空白对照组；将其置于培养箱继续培养24 h后收集各组细胞，参考试剂盒提取总蛋白，并测量其蛋白质量浓度，取60 μg蛋白进行后续操作，具体操作包括：①经SDS-PAGE电泳2 h；②湿性电转1.5 h至PVDF膜；③5%脱脂奶粉室温封闭1.5 h；④加一抗[caspase-3(稀释1∶1 000)、Bax(稀释1∶1 000)、Bcl-2(稀释1∶1 000)、β-actin(稀释1∶1 000)]，4 ℃过夜，洗涤3次；⑤加二抗(稀释1∶5 000)，室温孵育80 min；⑥洗膜后添加ECL液显影，在暗室凝胶成像仪下曝光成像。

2 结 果

2.1 MSC对NB细胞存活率的影响 MSC作用于NB细胞(SH-SY5Y细胞和SK-N-DZ细胞)24 h后，细胞存活率明显抑制；随着MSC浓度升高，SH-SY5Y细胞和SK-N-DZ细胞存活率均明显下降(见图1)，SH-SY5Y细胞和SK-N-DZ细胞的IC50分别为(47.89±1.74)μmol/L和(49.42±0.38)μmol/L。

图1 不同浓度MSC对NB细胞存活率的影响

2.2 MSC对NB细胞凋亡的影响 综合SH-SY5Y细胞和SK-N-DZ细胞的IC50结果，本研究后期仅选用浓度分别为5 μmol/L、25 μmol/L和50 μmol/L的MSC处理NB细胞，并设置空白对照组(无任何处理NB细胞)，经AnnexinV-PE和7-AAD染色后用流式细胞仪检测发现，与空白对照组(0 μmol/L)比较，经5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L MSC处理后SH-SY5Y细胞早期凋亡率明显增加，经25 μmol/L、50 μmol/L MSC处理后SK-N-DZ细胞早期凋亡率明显增加，差异均有统计学意义(P<0.01或P<0.001)。详见图2。

与0 μmol/L比较，＊P<0.01，＊＊P<0.001。

2.3 MSC对NB细胞周期的影响 不同浓度MSC处理后，SH-SY5Y和SK-N-DZ细胞周期G0/G1、S、G2/M比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。详见图3。

图3 MSC对NB细胞周期的影响

2.4 MSC对NB细胞凋亡相关蛋白的影响 与空白对照组(0 μmol/L)比较，经5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L的MSC干预后，SK-N-DZ细胞caspase-3和SH-SY5Y细胞caspase-9蛋白表达水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.01或P<0.001)，呈剂量依赖性，但caspase-8蛋白表达水平差异均无统计学意义(P>0.05)。详见图4。

与0 μmol/L比较，＊P<0.01，＊＊P<0.001。

3 讨 论

流行病学调查显示，我国NB发病率呈明显上升，每年新增病例约3 000例，仅次于白血病和中枢神经系统肿瘤疾病[8]。随着医疗科学技术不断完善，儿童NB治疗已在国际上形成较为规范的诊疗指南[9]，国内肿瘤学组也初步达成专家共识，认为低-中危患儿预后良好，其长期无瘤生存率达90%；高危患儿预后差，其长期无瘤生存率不超过50%，且后期复发及转移率高[10]。如何提高NB尤其难治性NB或者高危NB患儿的疗效仍是目前亟须解决的重要问题之一。

MSC是一种有机硒化合物，与无机硒及其他有机硒化物比较，其抗肿瘤作用强，安全性高。因此，国内外关于对其对抗肿瘤的研究相对较多[5]。Medina等[11]研究发现，MSC作为一种化学预防剂，在乳腺癌实验模型中的疗效优于以前使用的几种硒化合物，并展现出抗人乳腺癌的巨大潜能。Liu等[12]研究表明，MSC在延缓前列腺癌去势抵抗方面具有重要作用，为MSC联合雄激素治疗晚期前列腺癌提供理论依据。既往研究均表明，MSC可通过诱导肿瘤细胞凋亡抑制其生长，但其具体机制尚未明确。本研究通过MSC干预体外培养NB细胞株SH-SY5Y 和SK-N-DZ，探讨其诱导NB细胞凋亡的机制，为今后MSC在动物实验及临床应用提供理论依据。

本研究发现MSC可明显降低NB细胞(SH-SY5Y细胞和SK-N-DZ细胞)细胞存活率，且具有明显时间和浓度依赖性，SH-SY5Y细胞和SK-N-DZ细胞IC50分别为(47.89±1.74)μmol/L和(49.42±0.38)μmol/L，提示MSC在该浓度范围内抗肿瘤能力最佳，后续均在该浓度范围内进行研究。本研究细胞凋亡实验显示，与空白对照组比较，MSC处理后NB细胞早期凋亡率明显增加，尤以50 μmol/L MSC浓度最佳，提示MSC对NB细胞株增殖的抑制作用与其诱导细胞凋亡相关。

细胞周期是细胞生命活动的基本过程，维持细胞周期关卡是保证细胞正常运转的关键，一旦关卡功能失调，细胞即停滞于相应周期，若损伤DNA不能及时修复或超出细胞修复及耐受极限，均可导致细胞凋亡，由此认为细胞周期阻滞与细胞凋亡是密切相关的[13-14]。本研究结果显示，经不同浓度MSC处理后，SH-SY5Y和SK-N-DZ 细胞周期G0/G1、S、G2/M比较差异均无统计学意义，提示MSC对NB的抑制作用与细胞周期阻滞无相关性，而主要与细胞凋亡有关。

基于本实验结果，后续研究将集中于细胞凋亡机制研究。caspase 蛋白家族在哺乳动物细胞程序性死亡过程中占有重要地位。caspase-8和caspase-9 是位于凋亡级联效应上游的主要凋亡启动因子，而caspase-3则是caspases级联反应中下游最关键的凋亡执行蛋白酶，被激活后可促使细胞凋亡，其中caspase-8 活化主要与外源性细胞凋亡途径相关，而caspase-9主要与内源性细胞死亡途径相关。在本研究中，随MSC药物浓度增加，caspase-3 和caspase-9蛋白水平表达明显升高，但caspase-8蛋白表达水平无明显变化，提示MSC可通过内源性细胞凋亡途径激活诱导NB凋亡，但对外源性细胞凋亡途径无效。这与Wang等[15]的部分研究结果一致，认为MSC可通过改变caspase-8活性抑制细胞凋亡，维持细胞活力。

综上所述，MSC主要通过激活内源性凋亡通路诱导细胞凋亡抑制NB细胞生长，与细胞周期无相关性。