禽流感DNA疫苗(H5亚型Re-8株)对黄羽肉鸡免疫程序的优化

唐荣宏,范莉莉,王冬雪,李亚杰,郁宏伟,杨保收,鲍恩东

(天津瑞普生物技术股份有限公司,天津 300308)

禽流感(avian influenza,AI)是A类禽类烈性传染病之一,由正黏病毒科的A型流感病毒所引起,该病毒为单股、负链RNA病毒,禽类、鸟类、人类及低等哺乳动物为其易感动物[1]。A型流感病毒分为多种亚型,其中H5、H7亚型属于高致病性强毒株,由其引发的高致病性禽流感具有发病急、传播速度快、死亡率高等特点。2003年以来,H5亚型高致病性禽流感(highly pathogenic avian influenza,HPAI)在我国多数地区呈现不同程度的爆发,严重危害养禽业的健康发展[2]。不仅如此,我国已有HPAI(H5亚型)感染人并致死的报道[3-4]。H5亚型HPAI作为一种人兽共患病,对人类安全及动物健康具有严重危害,因此对其防控具有重要的经济及公共卫生意义。

目前我国主要采用免疫接种H5亚型禽流感灭活疫苗的方式来预防禽流感[5-6]。然而,禽流感灭活疫苗具有干扰临床检疫(检测)及流行病学调查等缺点。作为第3代疫苗的DNA疫苗不仅具有灭活苗的安全性,不会干扰临床检疫及流行病学调查,而且还具有以下优点:1)可诱导机体产生全面的免疫反应——体液免疫和细胞免疫;2)能不断刺激机体产生抗体,免疫效力持续时间长[7];3)有利于多价苗及多联苗的研制,疫苗生产简便、易于运输且成本低廉。因此,越来越多的学者致力于研究禽流感DNA疫苗,包括其免疫原性、免疫保护效力、与其他类型疫苗联合免疫等方面。与用同一种疫苗免疫相比,联合免疫更能刺激机体产生更强的体液免疫反应和更高的抗体效价[8-12]。本试验的主要目的在于探索禽流感(H5亚型Re-8株)DNA疫苗用于黄羽肉鸡的合理免疫程序,及其与H5亚型禽流感灭活苗联合免疫的免疫效果,为防控H5亚型禽流感提供新方法。

1 材料与方法

1.1 试验动物与受试疫苗

210羽1日龄黄羽肉鸡购自温氏公司沧州孵化场。受试疫苗H5禽流感D7+rD8二价灭活疫苗购自广州市华南农大生物药品有限公司(批号1709001);H5亚型禽流感DNA疫苗(pDNA Re-8)由天津瑞普生物技术股份有限公司生物制品研究分院提供(1.0 mg·mL-1,批号20160722)。

1.2 试验方法

1.2.1 试验分组将1日龄未免疫禽流感疫苗的210羽健康黄羽肉鸡随机均分为A、B、C、D、E、F、G共7组,每组30羽。具体分组及处理见表1。

表1 试验分组信息及免疫接种程序Table 1 Trial grouping information and immunization program

1.2.2 血清采集A、B和C组受试鸡分别于免疫前及免疫后1、2及3周采集血样;D、E、F组受试鸡于首免后1、2、3周以及加强免疫后1、2、4、6、8、10、12周采集血样;G组(空白对照组)受试鸡于1、7、14、21、28、35、42、49、63、77、91日龄时采集血样。各组受试鸡在各采样时间点均采取翅下静脉方式采集血液,每羽0.5 mL。分离血清作为待检样品。

1.2.3 抗体检测采用血凝(HA)及血凝抑制(HI)方法检测抗体滴液(HI效价log2)。具体操作按照《中国兽药典》(2005版)所述进行,即HA试验测出H5亚型禽流感Re-8株血凝价,根据测定的血凝价配制HI试验所需要的4单位抗原。检测结束后,对所得结果进行判断:阳性(HI效价≥4)、阴性(HI效价≤3)、可疑(3

1.3 数据处理

抗体滴度(HI效价)采用算数平均数表示;抗体合格率=合格抗体数/检测数×100%。用GraphPad及SPSS 16.0对试验数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 黄羽肉鸡禽流感母源抗体消长规律

空白对照G组受试鸡血清样品的抗体滴度(HI效价)效价检测结果如图1所示。黄羽肉鸡母源抗体HI效价在7～14 d时下降最快(由5.1降至3.5),抗体合格率也由88.9%降至39.3%。14 d后其母源抗体的保护作用显著降低,不足以产生对鸡群的免疫保护。

图1 黄羽肉鸡禽流感(H5亚型Re-8株)母源抗体消长规律及母源抗体合格率Fig.1 Fluctuation and growth of maternal antibody to avian influenza(H5 subtype RE-8 strain)in Yellow broiler and qualified rate of maternal antibody

2.2 禽流感DNA疫苗(H5亚型 Re-8株)单次免疫效果比较

不同日龄(1、10、14日龄)受试鸡单次免疫禽流感DNA疫苗(pDNA Re-8株)后其血清样品抗体滴度检测结果(图2)所示:C组(14日龄免疫)受试鸡血清抗体的HI效价及合格率在免疫DNA疫苗1周后即出现上升(由2.3升至4.1);B组(10日龄免疫)受试鸡血清抗体HI效价在免疫后2周出现上升(由3.5升至3.8);A组(1日龄组)受试鸡血清抗体HI效价免疫后3周内一直呈现下降趋势。统计学分析结果显示,A、B、C 3组受试鸡血清抗体HI效价及合格率差异均不显著(P>0.05),C组受试鸡呈现出的免疫效果优于A组和B组。

图2 禽流感DNA疫苗(H5亚型Re-8株)单次免疫效果(A)和抗体合格率(B)比较Fig.2 Comparison of single immune effect(A)and passing rate of antibody(B)of avian influenza DNA vaccine(H5 subtype RE-8 strain)

2.3 禽流感DNA疫苗加强免疫对黄羽肉鸡的免疫效果比较

用pDNA Re-8疫苗对黄羽肉鸡进行不同日龄首免后,再次追加免疫DNA疫苗或二价灭活疫苗,受试鸡血清禽流感病毒抗体滴度检测结果如图3所示。由图3可以看出:F组(10和31日龄2次经颈背部皮下注射H5禽流感D7+rD8二价灭活疫苗)受试鸡血清抗体HI效价最高;其次是E组受试鸡(10日龄,肌肉注射pDNA Re-8疫苗,31日龄时再次经过颈背部皮下注射H5禽流感D7+rD8二价灭活疫苗);而D组(14和35日龄2次经肌肉注射pDNA Re-8疫苗)受试鸡血清抗体HI效价普遍低于F组和E组。然而,3个试验组受试鸡血清中相应抗体的持续期均较长(抗体HI效价>5)。F组受试鸡抗体合格率在免疫期一直处于较高水平,D、E组受试鸡血清抗体合格率在免疫后持续增高,免疫后2周均达到50%以上,为鸡群提供较好的免疫保护。统计学分析结果显示,D、E 2组受试鸡的抗体HI效价及抗体合格率差异均不显著(P>0.05),而D、F 2组受试鸡血清抗体HI效价及抗体合格率差异显著(P<0.05),E、F 2组抗体HI效价及抗体合格率差异均不显著(P>0.05)。因此,F组的免疫效果最佳,其次是E组,然后是D组。D、E和F这3组受试鸡在免疫后抗体均能较快升至5.0,可为鸡群提供长期的免疫保护。

图3 加强免疫对H5禽流感DNA疫苗免疫鸡血清抗体滴度(HI效价,A)及抗体合格率(B)比较Fig.3 Comparison of HI titer(A)and passing rate(B)of serum antibody against H5 avian influenza DNA vaccine immunized chicken by enhanced immunization

3 讨论

近年来,AI新毒株在中国广泛传播并导致人感染[1,13],其中至少包含6个亚型(H5N1、H6N1、H7N9、H9N2、H10N8和H5N6)的AIV[14]。以常用的H5N1亚型禽流感灭活疫苗应对新出现的AIV或许已不能满足AI防控的要求了。目前关于DNA疫苗的研究较多,已显示出其在传染病预防方面的重要性[15-16]。因此,本文选取禽流感(H5亚型,Re-8株)DNA疫苗与在市面上销售的H5禽流感D7+rD8二价灭活疫苗进行免疫效果的评价与分析,为DNA疫苗的实际应用提供试验依据。

大部分灭活疫苗的免疫效果会受母源抗体的影响,而DNA疫苗的免疫效果不受母源抗体的影响[17]。为更加贴近生产实际,本研究将单次免疫禽流感疫苗的受试鸡日龄设为1、10和14日龄,试验结果显示黄羽肉鸡免疫禽流感DNA疫苗的最佳日龄为14日龄,其次为10日龄,这一结果与文献[18]的结果不同。究其原因,可能是随着雏鸡不断成长,其免疫系统发育愈发成熟,肌肉组织处于快速发育阶段,进入肌纤维的DNA质粒及表达的抗原越多,免疫系统对抗原的递呈越有效、应答越快[19-24],当低日龄进行DNA疫苗免疫时,雏鸡母源抗体过高会中和DNA疫苗抗原。

为探究较优的免疫程序以实现对黄羽肉鸡提供较好保护力,本研究将DNA疫苗与市售禽流感二价疫苗进行单独及联合免疫,结果显示,E组受试鸡血清抗体HI效价和抗体合格率在免疫期的前期低于F组,但其抗体水平足以达到保护鸡群免于AIV感染,且2组间的差异不显著,说明禽流感DNA疫苗与目前市售灭活苗联合免疫可以给鸡群提供良好免疫保护。本试验中,D组受试鸡免疫效果整体比E组及F组差,但其抗体HI效价大于4,免疫合格率大于50%,也可实现对鸡群的免疫保护。

通过对黄羽肉鸡禽流感DNA疫苗(H5亚型Re-8株)免疫效果和免疫程序研究,我们初步认为以下2种免疫程序可以获得对禽流感较佳的免疫保护效果:第1种为14日龄首免禽流感(H5亚型Re-8株)DNA疫苗,每羽30 μg,21 d后同等剂量加强免疫,其所产生的HI抗体足够保护鸡群免于AIV的感染;第2种为10日龄首免禽流感DNA疫苗,每羽30 μg,21 d后免疫禽流感H5亚型灭活苗0.3 mL,受试鸡产生的抗体高,持续期长。