河南烟区烤烟主要次生代谢产物含量的比较分析

张 希，王慧芳，徐世晓，薛 刚，杨铁钊

(河南农业大学 烟草学院，河南 郑州 450002)

次生代谢物是植物与环境长期作用的结果[1]，多为小分子有机物，一般包括有机酸、生物碱、酚类和甾醇类等化合物[2]。烟草次生代谢物质具有防御能力，同时还与烟草致香物质密切相关，是大多数致香物质的前体物。烟叶中有机酸含量为12%～16%，非挥发性有机酸对烟叶香吃味有重要影响，并且有机酸分解产生的酸性片段可调节烟气中质子化和游离态烟碱的比例[3]，从而直接影响烟叶的劲头和吃味[4]。李炎强等[5]研究得出，云南烤烟游离态和结合态脂肪酸总和是河南烤烟的1.42倍，不同地区的酸性脂肪酸成分含量不同。杨虹琦等[6]研究表明，低纬度烟区烤烟苹果酸、柠檬酸和总有机酸含量均低于中纬度和高纬度产区，烟叶有机酸含量因纬度高低不同而变化。生物碱在烟株体内的存在方式是与酸性物质结合成盐，主要包括烟碱、降烟碱、新烟草碱和假木贼碱4种[7]。生物碱的组成和含量是烟叶的重要质量要素，直接影响烟草制品的生理强度、烟气特征和安全性[8]。王鹏泽等[9]通过对比八大浓香型烤烟产区烟叶生物碱含量发现，河南豫中南产区和江西产区烤烟生物碱含量差异显著，其余产区差异不大。廉芸芸等[10]和梁盟等[11]研究表明，不同产区烤烟主要生物碱含量差异显著。烤烟中酚类物质含量为3.58%～4.25%，主要有绿原酸、芸香苷和莨菪亭[12]。烟草中的酚类化合物与烟草香味有关，并且与烟草及其制品的等级呈正相关[13]。武丽等[14]研究表明，云南、贵州等高海拔烟区烟叶多酚含量高于辽宁、安徽等低海拔烟区。钟维勇等[15]和冉霞等[16]通过对比西南烟区和贵州不同产区烤烟的主要多酚含量，获得多酚物质总量、分布及水平的显著差异信息。甾醇是烟叶中的一类甾族化合物，大约占烟叶质量的0.1%～0.3%，主要包括胆甾醇、菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇等，浓香型烤烟豆甾醇含量高于β-谷甾醇含量[17]，不同烤烟品种游离态甾醇总量及各游离态甾醇含量存在差异[18]。

河南烤烟在卷烟原料配方中多作为主料烟和调味料使用，近几年，河南浓香型烟叶质量有下降的趋势，而烟叶次生代谢物质与烟叶品质息息相关，关于河南烟区烟草次生代谢物质的研究仅有关于生物碱[9]和有机酸[19]的报道，河南不同烟区烟叶有机酸、生物碱、多酚和甾醇含量的差异却鲜见系统报道。因此，选取2019年河南主要烟区主栽烤烟品种烤后烟叶，采用气相色谱-质谱监测法(GC/MS-SIM)、气相色谱-质谱联用法(GS-MS)、高效液相色谱法(HPLC)、超高效液相色谱-质谱法(UPLC-MS)分别检测12种有机酸、9种生物碱、4种游离态甾醇和3种多酚类物质，分析各个成分含量在不同产区的差异，为河南优质烤烟生产和烟叶合理利用提供理论参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料与仪器

试验于2019年在河南省南阳方城、平顶山郏县、三门峡卢氏、驻马店泌阳、洛阳洛宁、许昌襄县和漯河临颍7个烤烟产区进行，各产区试验点均采用小区试验，小区面积200 m2，行株距1.2 m×0.5 m。包括云烟87、秦烟96、贵烟2号、豫烟6号、中烟100等品种，分B2F和C3F两个等级。将烟叶于60 ℃下烘干，用粉碎机粉碎，过孔径为0.02 mm筛后保存。

主要仪器：BSA224S电子天平(感量0.000 1 g,北京赛多利斯仪器系统有限公司)、Thermo Scientific Barnstead Pacific TⅡ级纯水仪(美国Thermo Scientific公司)、SB25-12 DTD超声波清洗器(宁波新芝生物科技有限公司)、Agilent 1100型液相色谱仪(美国Agilent公司)、Agilent 6890型气相色谱仪(美国Agilent公司)、气相色谱-质谱联用仪(美国Agilent公司)。

1.2 测定项目和方法

采用GC/MS-SIM[20]定量分析烟叶有机酸类物质含量；采用GC-MS测定烟叶生物碱含量，具体操作及参数设计参照LI等[21]的方法进行；参照YC/T 202—2006测定烟草多酚类物质含量[22]；采用UPLC-MS法测定烟草游离态甾醇含量[23]。

各等级样品重复测定3次，B2F和C3F两个等级烟叶测定结果的平均值即为样品测定结果。各个地区测定结果为相应样品测定结果的平均值。

1.3 数据处理与分析

采用SPSS 22.0和Excel 2016软件进行数据统计和作图。

2 结果与分析

2.1 河南不同产区烤烟次生代谢物质含量分析

如表1所示，河南不同产区烤烟有机酸含量为120.01～216.01 mg/g；生物碱含量为18.85～27.97 mg/g；多酚含量为16.85～27.92 mg/g；甾醇含量为2.11～2.87 mg/g。其中，有机酸含量的变异系数最大，其次为多酚和生物碱含量，甾醇含量的变异系数最小。不同类型次生代谢产物占次生代谢物质总量的比例不同，有机酸为烟叶次生代谢产物的主要成分，其含量占总量的76.20%；生物碱和多酚含量分别占总量的11.61%和10.91%；甾醇含量最低，仅占1.28%。从偏度系数来看，烤烟有机酸、生物碱和多酚含量的偏度系数均大于0，数据呈正偏态；甾醇的偏度系数小于0，数据呈负偏态。从峰度系数来看，有机酸和甾醇含量的峰度系数大于0，为尖峭峰，数据分布较为集中；生物碱和多酚的偏度系数小于0，为平阔峰。

表1 河南不同产区烤烟次生代谢产物含量的描述统计Tab.1 Descriptive statistics of the content of secondary metabolites of flue-cured tobacco in different production areas in Henan

如图1所示，河南不同产区烟叶次生代谢产物总量平均值表现为方城>洛宁>泌阳>卢氏>郏县>襄县>临颍；烤烟有机酸总量在不同产区表现为方城>洛宁>泌阳>卢氏>郏县>襄县>临颍；烤烟生物碱总量在不同产区表现为方城>郏县>泌阳>卢氏>襄县>临颍>洛宁；烤烟多酚物质总量在不同产区表现为襄县>郏县>方城>卢氏>洛宁>临颍>泌阳；烤烟甾醇总量在不同产区表现为洛宁>卢氏>泌阳>方城>襄县>临颍>郏县。

图1 河南不同产区烟叶中的次生代谢物质含量Fig.1 Contents of secondary metabolites in tobacco leaves from different producing areas in Henan

2.2 河南不同产区烤烟有机酸含量

如表2所示，河南产区烤烟有机酸各组分含量表现为苹果酸>柠檬酸>草酸>2,4-庚二烯酸>丙二酸>γ-戊酮酸>十六酸>富马酸>亚油酸>丁二酸>油酸>十八酸。其中，苹果酸、柠檬酸和草酸含量相对较高，是有机酸的主要成分，占有机酸总量的84.27%；丁二酸、油酸和十八酸含量较低。草酸、苹果酸和亚油酸含量的变异系数较大，其他有机酸含量差异不大。从峰度系数来看，丙二酸、γ-戊酮酸、苹果酸、2,4-庚二烯酸、柠檬酸、十六酸、亚油酸、油酸含量的峰度系数小于0，为平阔峰，数据比较分散；其他有机酸含量的峰度系数大于0，为尖峭峰，数据大多数集中在平均值附近。从偏度系数来看，丙二酸、γ-戊酮酸、富马酸、丁二酸和十八酸含量的偏度系数小于0，数据呈负偏态；其他有机酸含量均大于0，呈正偏态。

表2 河南不同产区烤烟有机酸含量的描述统计Tab.2 Descriptive statistics of organic acids content of flue-cured tobacco in different production areas in Henan

由表3可知，河南不同产区烤烟中有机酸含量差异明显，方城烤烟有机酸含量最高，分别是临颍、襄县、郏县、卢氏、泌阳、洛宁的1.80、1.73、1.69、1.56、1.39、1.19倍；洛宁和泌阳烟叶主要有机酸含量居中，平均为180.83、155.06 mg/g；卢氏、郏县、襄县和临颍烤烟有机酸含量较低，平均为138.47、127.27、124.76、120.01 mg/g。河南不同产区烤烟苹果酸含量相对较高,表现为方城>洛宁>泌阳>卢氏>郏县>临颍>襄县，柠檬酸含量表现为方城>泌阳>卢氏>襄县>临颍>洛宁>郏县，草酸含量表现为方城>洛宁>泌阳>襄县>临颍>郏县>卢氏。

表3 河南不同产区烤烟有机酸含量

2.3 河南不同产区烤烟生物碱含量

由表4可知，河南不同产区烤烟生物碱各组分含量之间存在较大变异，异烟碱含量的变异系数最大，N-甲基烟碱含量的变异系数最小。烟草生物碱的主要成分是烟碱、降烟碱、假木贼碱和新烟草碱，占生物碱总量的99.22%。生物碱各组分平均含量表现为烟碱>新烟草碱>降烟碱>假木贼碱>麦斯明>异烟碱>可替宁>二烯烟碱>N-甲基烟碱。从偏度系数来看，假木贼碱和可替宁含量的偏度系数小于0，数据分布呈负偏态，其他生物碱组分含量和生物碱总量的偏度系数均大于0，数据分布呈正偏态；从峰度系数来看，烟碱、降烟碱、麦斯明、N-甲基烟碱、可替宁和生物碱总量的峰度系数均小于0，为平阔峰，数据比较分散；其余生物碱组分含量的峰度系数均大于0，为尖峭峰，数据分布比较集中。

由表5可知，河南不同产区烟叶生物碱含量差异明显，就不同产区烟叶生物碱含量的平均值来看，以方城和郏县的生物碱总量最高，分别为27.97 mg/g和27.84 mg/g；临颍和洛宁的生物碱总量较低，分别为20.60 mg/g和18.85 mg/g；其他产区生物碱含量居中，为21.05～23.07 mg/g。不同地区烟叶样品烟碱含量同生物碱总量趋势一致，方城和郏县烟碱含量最高，分别为27.07 mg/g和26.71 mg/g，临颍和洛宁的烟碱含量较低，分别为19.92 mg/g和18.07 mg/g，其他产区烟碱含量居中。

表4 河南不同产区烤烟生物碱含量的描述统计Tab.4 Descriptive statistics of flue-cured tobacco alkaloid content in different production areas in Henan

2.4 河南不同产区烤烟多酚类物质含量

由表6可知，河南主产烟区烤烟多酚物质总量为16.85～27.92 mg/g，平均含量为21.74 mg/g。其中，绿原酸平均含量为12.33 mg/g，占多酚类物质总量的56.72%；其次是芸香苷含量，为9.28 mg/g，占多酚类物质总量的42.69%；莨菪亭含量最低，仅为0.13 mg/g，仅占0.59%。烤烟多酚类物质各组分含量之间存在较大变异，其中，莨菪亭含量的变异系数最大，绿原酸含量的变异系数最小。烤烟多酚类物质各组分含量和总量的偏度系数均大于0，数据分布呈正偏态。芸香苷含量的峰度系数大于0，为尖峭峰，数据分布比较集中；多酚其他组分含量和总量的峰度系数小于0，为平阔峰，数据比较分散。

表6 河南不同产区烤烟多酚类物质含量的描述统计Tab.6 Descriptive statistics of polyphenols content in flue-cured tobacco in different production areas in Henan

由表7可知，河南不同烟区烤烟绿原酸含量表现为郏县>襄县>方城>卢氏>泌阳>洛宁>临颍，芸香苷含量表现为襄县>卢氏>方城>临颍>郏县>洛宁>泌阳，莨菪亭含量表现为泌阳>方城>临颍>洛宁>卢氏，襄县和郏县烤烟莨菪亭含量较低且无差异。

表7 河南不同产区烤烟多酚类物质含量Tab.7 The content of polyphenols in flue-cured tobacco in different producing areas in Henan mg/g

2.5 河南不同产区烤烟甾醇含量

由表8可知，河南主产烟区烤烟甾醇总含量为2.11～2.87 mg/g，平均含量为2.54 mg/g。从具体成分来看，豆甾醇、β-谷甾醇、菜油甾醇和胆甾醇含量分别占甾醇总含量的33.86%、33.07%、18.50%和14.57%。烤烟甾醇各组分含量之间存在较大的变异，其中β-谷甾醇含量的变异系数最大，豆甾醇含量的变异系数最小。从偏度系数来看，豆甾醇和β-谷甾醇含量的偏度系数大于0，数据分布呈正偏态；其他甾醇组分含量和甾醇总量的偏度系数小于0，数据分布呈负偏态。从峰度系数来看，豆甾醇和胆甾醇含量的峰度系数小于0，为平阔峰，数据比较分散；其他组分含量和甾醇总量的峰度系数大于0，为尖峭峰，数据比较集中。

表8 河南不同产区烤烟甾醇含量的描述统计Tab.8 Descriptive statistics of sterol content in flue-cured tobacco in different producing areas in Henan

烤烟甾醇含量如表9所示。由表9可知，河南不同产区烤烟甾醇含量以洛宁最高，为2.871 0 mg/g，其次是卢氏、泌阳、方城和襄县，其烟叶甾醇含量分别为2.666 9、2.644 1、2.608 1、2.598 9 mg/g，临颍和郏县烟叶甾醇含量较低，分别为2.284 9 mg/g和2.105 1 mg/g。

表9 河南不同产区烤烟甾醇含量Tab.9 The content of sterol in flue-cured tobacco in different producing areas in Henan mg/g

3 结论与讨论

通过对河南省南阳方城、平顶山郏县、三门峡卢氏、驻马店泌阳、洛阳洛宁、许昌襄县和漯河临颍7个不同烟叶产区的多点取样分析，结果表明，各个烟叶产区烤烟有机酸、生物碱、多酚和甾醇含量存在较大差异，其中，方城产区的烟叶次生代谢物质总量最高，临颍产区最低。刘春奎等[19]研究表明，河南烤烟非挥发有机酸含量平均值为134.10 mg/g，低于本研究中有机酸含量(151.77 mg/g)，这可能是由于研究年份较为久远，与现行栽培措施存在差异所致。河南烤烟有机酸和甾醇含量高于耿召良等[24]对贵州烤烟的测定结果(分别为112.47 mg/g和2.54 mg/g)，但多酚和生物碱含量低于贵州烤烟(分别为33.65 mg/g和29.79 mg/g)。沈剑波[25]对比浓香型与清香型烤烟发现，河南与贵州由于南北方烟区生态条件不同造成次生代谢产物含量方面的差异。

河南不同产区烤烟中有机酸、生物碱、多酚和甾醇4类次生代谢产物主要成分含量组成各不相同。方城县烤烟有机酸含量和生物碱含量明显高于其他县，其他成分均居中且都高于平均值；襄县烤烟多酚含量最高，甾醇含量高于平均值；洛宁县烤烟甾醇含量最高，有机酸和生物碱含量均低于平均值；卢氏县烤烟多酚和甾醇含量高于平均值，有机酸和生物碱含量均低于平均值；泌阳县烤烟有机酸和甾醇含量高于平均值，生物碱和多酚含量低于平均值；郏县烤烟生物碱和多酚含量高于平均值，有机酸和甾醇含量低于平均值；临颍烤烟有机酸、生物碱、多酚和甾醇含量均低于平均值。

河南不同烟区的地形地貌、土壤条件和生态气候均不相同，这些原因导致各产区烟叶特性的差异[26-28]。郏县、襄县和临颍均处于豫中平原烤烟区，烤烟生长季节的温度和降雨与烤烟生长需要配合不适宜，影响烤烟旺长。从研究结果看，郏县、襄县和临颍烤烟的次生代谢产物含量较低，导致近年来烟叶品质下降，烟叶特征香气减弱。洛宁和卢氏地处豫西丘陵山地烤烟区，烤烟多生长在海拔300～1 000 m的低山丘陵区，土壤熟化度低，通透性差，肥力低。从研究结果看，洛宁、卢氏地区的甾醇含量最高，导致这2个产区烟叶杂气、劲头和刺激性较大，这可能在一定程度上影响了烟叶品质。方城和泌阳地处豫南鄂北盆地岗地烤烟区，阳光充足、雨量适中，土壤保水保肥、耕性良好。从研究结果看，方城和泌阳烤烟的次生代谢产物含量较高，说明充足的光照和降雨有利于烟叶内含物的积累，一定程度上保证了烟叶质量。

本研究结果表明，河南不同产区所产的烟叶次生代谢物质总量不同，这很大程度上是土壤、气候等生态条件的原因，也与烟草水肥条件、栽培措施、烘烤条件有很大关系[29]。河南不同烟区烤烟次生代谢产物含量的特点可为烟草高香气育种研究和优质烟栽培提供理论依据，另外，卷烟工业可以根据不同烟区原料资源特征，择优选用，科学配方。