UPLC-Q-TOF-MS联合UNIFI筛查平台快速分析湘产大青叶化学成分

何雨晴，陈迪路，张郑洁，李翎熙，谷青青，周小江，张忠勤

(1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.湖南振兴中药有限公司，湖南 长沙 410208)

大青叶是湖南省的一味特色中药，为马鞭草科植物路边青ClerodendrumcyrtophyllumTurcz的干燥叶，又称淡婆婆叶[1]。收载于《湖南省中药材标准》(2009版)，具有清热解毒、凉血止血的功效，用于外感热病热盛烦渴、咽喉肿痛、口疮、黄疸、热毒痢、急性肠炎等症[2]。路边青常生长在山地林边、路旁及溪谷旁，主要分布于湖南省的安化、桃江、耒阳、祁东、长沙等地[3，4]。近年来，随着大青叶市场需求量不断增大，其野生资源逐渐枯竭，人工种植开始出现，其栽培方法为种子繁殖或分株法繁殖[5]。湘产大青叶含有黄酮类、二萜类、三萜类、甾醇类、糖苷类等成分，具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗肿瘤等作用[6]，但其药效物质基础不明确，质量控制标准不完善。为了阐明湘产大青叶的药效物质基础，笔者特采用UPLC-Q-TOF-MS法对湘产大青叶正丁醇提取物中的成分进行分析，结合后续的药效学研究结果，为阐明其药效物质基础提供科学数据，为提升其质量标准提供依据。

1 实验材料

1.1 仪器

Xevo G2-XS QTOF/MS、Masslynx V4.1工作站、UNIFI科学信息学系统(美国 Waters 公司)；AS系列超声波清洗机(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)；CP214分析天平(奥豪斯仪器有限公司)；Sorvall ST 8R高速冷冻离心机(赛默飞世尔科技有限公司)

1.2 材料与试剂

大青叶药材于2018年7月采自新邵常春藤中药材种植基地，经湖南中医药大学中药鉴定教研室周小江教授鉴定为马鞭草科植物路边青ClerodendrumcyrtophyllumTurcz的叶。

95%乙醇(分析纯，上海泰坦化学有限公司)纯净水(华润怡宝饮料有限公司)；正丁醇(分析纯，上海泰坦化学有限公司)；甲醇(色谱纯，美国TEDIA公司；质谱纯，美国 Fisher 公司)。

2 方法

2.1 样品溶液的制备

湘产大青叶药材0.5 kg，用8倍量70%乙醇回流提取2次，每次1 h，滤过，合并滤液，减压回收乙醇，用等体积的水饱和正丁醇萃取10次，减压回收正丁醇并浓缩，真空干燥得正丁醇提取物。

取正丁醇提取物约0.01 g，精密称定，加10 mL甲醇溶解，以15 000 r/min 离心15 min，取上清液过0.22 μm滤膜，即得。

2.2 检测条件

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Phenomenex C18(2.1 mm×100 mm，1.6 μm)；流动相：A为0.1%的甲酸水，B为甲醇；梯度洗脱程序：0～3 min，5%～10% B；3～6 min，10%～45% B；6～10 min，45%～55% B；10～15 min，55%～80% B，15～27 min，80%～100% B，27～30 min，100% B，30～31 min，5% B，31～35 min，5% B。流速0.3 mL/min，柱温35 ℃，进样量2 μL。

2.2.2 质谱条件 电喷雾离子源(ESI)正负离子模式采集，离子源温度100 ℃；脱溶剂气温度400 ℃；脱溶剂气(N2)流速600 L/h；扫描范围m/z100～1200；毛细管电压2.5 kV；锥孔气体流速50 L/h；锥孔电压40 V；亮氨酸-脑啡肽[M-H]-=554.2620作为LockSpray校准液(200 pg/mL)，流速10 μL/min，可产生碎片离子m/z556.2771[M+H]+。甲酸钠溶液用来仪器校正。使用MassLynx V4.1和以中药数据库为基础的UNIFITM软件进行数据采集与分析。

3 结果与分析

取湘产大青叶样品溶液，按“2.2”项下检测条件进行分析，获得正、负离子模式全扫描总离子流，见图1。由于正离子检测模式下各成分的分离效果优于负离子检测模式，且响应值高，故对正离子检测结果进行分析，首先通过相关文献以及质谱数据库(Chemspider，SDBS，SCIfinder)的查询，对已有化合物进行总结，建立湘产大青叶UNIFI数据库。结合UNIFI软件的自动筛查功能，初步得到质谱数据分析结果，通过化合物裂解规律以及相关化合物质谱数据对软件给出的可能存在的化合物列表进行手动鉴定，最终共鉴定出32个化合物。其中黄酮类及黄酮苷类成分9个，甾体类及萜类成分共7个，苯乙醇类成分3个及其他类成分13个，化合物保留时间、准分子离子及碎片离子信息详见表1。

图1 两种检测模式下湘产大青叶的总离子流

3.1 化学成分的裂解特征分析

3.1.1 黄酮类成分鉴定 化合物2母核离子m/z359.1483[M+H]+，通过UNIFI拟合得到化合物分子式为C27H30O15，化合物名称为5-羟基-3，6，7，4′-四甲氧基黄酮，其特征碎片为丢失一分子甲基形成的m/z344.1372[M-CH3]+及陆续丢失羰基、甲氧基、甲基形成的碎片m/z301.1067[M-2CH3-CO]+、255.1081[M-2CH3-2CO-H2O]+、194.0912[M-C10H10O2-2H]+，根据裂解规律及与文献[7]对比，故推测其为5-羟基-3，6，7，4′-四甲氧基黄酮，5-羟基-3，6，7，4′-四甲氧基黄酮可能的裂解途径见图2。

化合物11母核离子m/z287.0534[M+H]+，其离子碎片为243.0467[M+H-CO]+、259.0283[M+2H-CO-OH]+、218.2107[M+3H-CO-C2H2O]+、163.0383[M+H-CO-C6H7O-H]+，结合文献[8]与裂解规律进行分析，推测为山奈酚。

化合物12母核离子m/z449.1064[M+H]+，其离子碎片为苷元碎片m/z287.0534[M+H-Glu]+、213.1949[M+H-Glu-2CO-H2O]+、163.0381[M+K-Glu-C9H6O3]+，根据UNIFI筛查结果推测为山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷或槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷，结合文献[9]与裂解规律，推测其为山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物13母核离子m/z449.1024[M+H]+，其特征碎片为m/z457.2335[M+H+H2O]+，301.0693[M-Rha]+，经软件筛查与文献[10]对比推测为槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷。

化合物14母核离子m/z317.0638[M+H]+，其离子碎片为m/z302.0400[M+H-CH3]+、285.1289[M-CO-3H]+、274.0458[M+2H-CO2]+，通过比对文献[11]，推测为胡麻素。

化合物15母核离子m/z463.1222[M+H+Na]+，其特征碎片为286.0454[M-Glu]+、258.0507[M-Glu-CO]+，通过比对文献[12]，推测化合物为5，7-二羟基-3′-甲氧基黄酮-4′-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物16母核离子m/z301.0692[M+H]+，化合物19母核离子m/z271.0590[M+H]+，化合物26母核离子m/z314.8505[M]+，经UNIFI筛查推测后与文献[13-15]进行比对，分别推测为金圣草素、芹菜醇以及cirsimartin。

表1 正离子模式下湘产大青叶提取物化学成分UPLC-Q-TOF/MS鉴定结果

3.1.2 甾体类及萜类成分鉴定 化合物4母核离子为m/z427.1261[M+H]+，其碎片离子为m/z411.1609[M-CH3]+、367.1018[M-2CH3-CO-H]+、272.2984[M+2H-C10H20O]+、252.0936[M+2H-C11H28O]+、205.0531[M+H-C15H26O]+，结合文献[33]进行分析，推测其为friedelin。

化合物9母核离子为m/z457.3683[M+H]+，其碎片离子为m/z475.3234[M+H+H2O]+、435.3309[M+H+Na-COOH]+、247.2159[M+H-C13H22O2]+、209.1635[M+H-C14H26O2]+，结合文献[16]进行分析，推测其为3-表齐墩果酸。

化合物30母核离子为m/z413.2626[M+H]+，其碎片离子为m/z414.2697[M+2H]+、279.0932[M+2H+H2O-C10H17O]+、301.1395[M-C8H15]+，经比对数据库，推测为clerosterol。

图2 5-羟基-3，6，7，4′-四甲氧基黄酮可能的裂解途径

化合物32母核离子为m/z413.3756[M+H]+，其碎片离子为m/z256.2613[M+H-C10H19-H2O]+、219.1724[M+3H-C13H24O]+、203.1410[M-C14H27O]+，结合文献[34]与裂解规律，推测为豆甾醇。

化合物17母核离子为m/z301.0720[M+H]+，其碎片离子为m/z286.0466[M+H-CH3]+、258.0527[M+H-CH3-CO]+，通过比对文献[17]，推测为Sugiol。

化合物18母核离子为m/z359.2306[M+H]+，其碎片离子为m/z340.7579[M-H2O]+、287.1479[M+2H-C4H9O]+、276.3673[M+3H-C4H5O2]+，结合文献[18]与碎片离子裂解规律，推测其为cyrtophyllones A。

化合物31母核离子为m/z332.2691[M]+，其碎片离子为m/z301.1403[M-CH2OH]+、246.0363[M+H-C4H7O2]+、201.0448[M+H-C7H16O2]+、177.1238[M+H-C7H18O4]+，结合文献[18]与碎片离子裂解规律，推测其为cyrtophyllones B。

3.1.3 苯乙醇类成分鉴定 化合物22母核离子为m/z625.1027[M+H]+，其离子碎片为645.4435[M+Na-2H]+、322.2474[M-Rha-C8H9O3-2H]+、163.0414[M-C8H9O3-Rha-Glu]+、137.0244[M-C9H7O3-Rha-Glu]+，经碎片离子裂解规律与文献[19]比对，推测其为acteoside。

化合物7与化合物8母核离子均为m/z647.1937[M+Na]+，经UNIFI筛查，推测其为异类叶升麻苷或parvifloroside B，经文献[20-21]对比，既包含异类叶升麻苷的特征离子为m/z477.3296[M-Rha]+、 323.2496[M-Rha-C8H10O3]+、340.0072[M-Rha-C8H9O2]+，也包含parvifloroside B的m/z471.0188[M+H-aglycone]+、323.2496[M-aglycone-Rha-H]+、163.0387[M+H-aglycone-Rha-Glu]+，故推测保留时间tR为7.691 min，异类叶升麻苷或parvifloroside B同时出峰。

3.1.4 其他类成分鉴定 本实验根据UNIFI筛查的结果结合文献和在线数据库搜索从湘产大青叶中共鉴定出了13个其他类成分，分别为马鞭草苷、5-羟基马鞭草苷、靛蓝、adenosine、(+)-phillyrin、龙胆苦苷、色胺酮、异落叶松脂素、斯巴醇、芳姜黄烯、十六酸甲酯、Methyl (10S)-hydroxypheophorbide a、(10S)-Hydroxypheophytin a。

化合物3母核离子为m/z389.1425[M+H]+，其特征离子为m/z387.1620[M-H]+、227.1733[M-Glu+H]+，结合文献[22]对比，推测为马鞭草苷。

化合物5母核离子为406.2048[M+2H]+，其特征离子为m/z427.1275[M+Na]+、245.0974[M-Glu+3H]+，结合文献[23]对比，推测为5-羟基马鞭草苷。

化合物24碎片离子为m/z265.1749[M+3H]+、263.0792[M+H]+、247.3534[M-NH]+、235.4095[M+H-CO]+、219.1762[M+H-NH-CO]+，结合文献[24]对比，推测为靛蓝。

化合物27母核离子为m/z268.1029[M+H]+、136.0618[M+H-C5H8O4]+，结合文献[25]对比，推测为adenosine。

化合物29母核离子为m/z535.3401[M+H]+，碎片离子为393.3018[M+Na-Glu]+、365.2579[M+2H+Na-Glu-OCH3]+，结合文献[26]及碎片信息，推测为(+)-phillyrin。

化合物1母核离子为m/z357.1144[M+H]+，碎片离子为377.1475[M+Na-2H]+、355.0979[M-H]+、195.0725[M+2H-Glu]+，经比对文献[22]，推测为龙胆苦苷。

4 讨论

本实验首次采用UPLC-Q-TOF-MS联用技术结合UNIFI筛查平台对湘产大青叶正丁醇提取物化学成分进行分析，再利用在线数据库(Chemspider，SDBS，SCIfinder)检索与相关文献对筛查出来的化合物进行确认，大大提高了鉴定化合物的效率。最终共鉴定出32个化合物，其中黄酮类成分9个，甾体类及萜类成分共7个，苯乙醇类成分3个，其他类成分13个。

实验过程中通过调节流动相的比例及洗脱时间确定色谱条件，对正、负离子扫描模式进行比较，发现在正离子模式下，化合物分离度更好、信息更丰富，最终确定色谱条件和质谱条件。实验过程中为了消除样品浸膏中残留的正丁醇，取少量浸膏用色谱纯甲醇溶解，减压干燥，重复3次。前期采用MTT法检测湘产大青叶正丁醇提取物对小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞增殖活性的影响，实验结果表明，湘产大青叶正丁醇提取物浓度越大，细胞活性越低，表明有细胞毒性作用。ELISA实验结果表明湘产大青叶正丁醇提取物与LPS模型组比较没有显著性差异，不能排除细胞毒性作用，还需分离纯化得到单体化合物后进行抗炎活性部位筛选。

湘产大青叶收载于《湖南省中药材标准》(2009年版)，其质量标准仅有性状、鉴别、水分测定等内容，缺含量测定项。本研究分析鉴定出了32个化合物，后续研究可对其中量大的化合物进行分离纯化，作为对照品，进行含量测定和特征图谱研究，从而为完善和提升湘产大青叶的质量控制标准奠定基础。