蓝刺头对PMOP大鼠体质量时序性变化、子宫组织形态的影响

刘 晋，赵 军

(1.内蒙古自治区中医医院，内蒙古 呼和浩特 010020；2.内蒙古医科大学附属医院，内蒙古 呼和浩特 010110)

绝经后骨质疏松症(Postmenopausal osteoporosis，PMOP)属高转换型的原发性骨质疏松症，是一种由于绝经后妇女卵巢功能衰退、雌激素水平下降，继发甲状旁腺功能亢进、降钙素分泌不足，从而导致骨吸收大于骨形成，骨量逐渐减少，以单位体积骨量减少和骨组织微结构退变、破坏为特征，最终导致骨骼脆性增加而易于发生骨折的全身代谢障碍性骨病[1]。流行病学资料显示中国大于60岁人群中的女性原发性骨质疏松症发病率为28.6%，并趋向于逐年升高[2]，因此，寻求有效预防和治疗PMOP的方法有重要现实价值。目前，现代医学用于治疗PMOP的药物较多，但各类药物的有效性与安全性均存在争议，如长期使用雌激素类药物有导致乳腺癌、子宫内膜癌及发生血栓的潜在危险，其风险甚至超过受益；而长期补钙易增加心血管事件风险[3]。所以在传统民族医药中寻求疗效可靠、毒副作用小的防治方法具有重要意义。但在众多有关传统民族医药防治骨质疏松症的动物实验中，研究方向多为从骨代谢细胞因子、免疫组化学，甚至受体基因调控机制等角度探讨其作用机理，而有关药物对体质量的影响，以及对子宫的安全性，尤其是和目前临床常应用的雌激素替代疗法相比较，其研究报道相对较少。

本研究所用的民族药蓝刺头(蒙医名“乌日格斯图呼和”)，菊科蓝刺头属，漏芦的干燥头状花序，载于蒙医医典《智慧文鉴》，有固骨质、接骨愈伤之功效，用于治疗筋伤骨折、金创、刺痛等症[4]。

前期课题已对蓝刺头有效成分进行了提取，证明了蓝刺头具有类雌激素样作用，能够有效防治PMOP。本次实验通过摘除大鼠卵巢的经典方法复制绝经后骨质疏松动物模型，通过合理随机对照分组、科学给药、检测体质量时序性变化、子宫病理学计量指标、骨密度(BMD)，并与阳性对照药物进行比较，旨在进一步探究蓝刺头安全性，为传统中医药资源开发及利用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 药品、试剂与仪器 蓝刺头制剂由广州中医药大学科技产业园有限公司提供。强骨胶囊：北京岐黄制药有限公司，规格：0.25 g/粒，批号：20181103。己烯雌酚片：合肥久联制药有限公司，规格：0.5 mg/片，批号：20181004。 试剂：苏木素-伊红(HE)染液、5%碱性美蓝溶液、亚甲基蓝染液、乙醚、庆大霉素、酒精、碘酒、4% 甲醛溶液、二甲苯、氨水、PBS缓冲液、石蜡。仪器：3 000 r/min低速离心机，北京医用离心机厂出品；100倍Olympus SZX19型显微镜，日本奥林巴斯公司；图像分析仪(清华同方Motic Image Advanced 3.0)、隔水式电热恒温培养箱、电热恒温鼓风干燥箱、冰箱、切片机，内蒙古医科大学病理学实验中心；1/1 000电子称，型号JA503，凯丰集团有限公司；电子计重称：ACS-H1型，上海海康电子仪器厂。

其他器械：大鼠灌胃器、手术刀、动物手术板、组织剪、断头器、尖头和圆头镊、手术用圆针和三棱针、持针器、止血钳、手术缝合线、无菌洞巾、医用纱布、棉签、10 mL注射器、研钵、玻璃棒、烧杯、移液枪枪头、玻璃钟罩、10 mL玻璃离心管、载玻片、数据纸、保鲜袋等相关实验器材。

1.2 实验动物及饲养环境

4月龄清洁级雌性Wistar大鼠84只，平均体质量(250.00±20.00)g，购于内蒙古大学实验动物研究中心，合格证号：SCXK(蒙)2002-0001。

大鼠饲养条件一致：内蒙古医科大学基础实验楼病理学实验室，环境清洁，恒温、恒湿，室温(25±2)℃，空气湿度55%～65%，自然光照明，换气风扇通风良好，适应性喂养7天；标准鼠饲料喂养(由内蒙古大学实验动物中心提供)，分笼饲养，自由摄食、水；饲养期间每7日称1次体重，并每日记录动物饲养室的温度变化。

1.3 动物分组及建模

分组：随机法依次分模型组、假手术组、蓝刺头高、中、低剂量组、强骨胶囊组、己烯雌酚组共7组，每组12只，亚甲基蓝染液分别编号。

建立PMOP大鼠模型：方法参照文献[5]，用乙醚麻醉大鼠后，仰位固定，下腹备皮，铺无菌洞巾，外科常规消毒，沿下腹部正中线2 cm切口打开腹腔，除假手术组(只切除卵巢周围少量脂肪，不切卵巢)外，其余各组大鼠均完整摘除双侧卵巢，伤口内滴入适量庆大霉素水溶液，止血后分层缝合。术后各组大鼠切口严格消毒。

术后恢复5天，逐只进行阴道上皮细胞角化实验[6]，连续观察5天，假手术组大鼠阴道涂片细胞主要由有核上皮细胞、角化上皮细胞和白细胞组成(图1A)，而模型组则以白细胞为主(图1B)，提示造模成功。

图1 光镜下大鼠阴道脱落细胞涂片

1.3 药物干预和标本采集

药物干预：手术造模确认成功后，各组大鼠分笼自由饲养90天后开始给予药物干预。模型组和假手术组予相应体积0.9%氯化钠溶液灌胃，蓝刺头高、中、低剂量组按生药根据人鼠体表面积折算后，分别以13 mg/mL、6.5 mg/mL、3.25 mg/mL的剂量灌胃给药，以低剂量组为临床等效剂量；强骨胶囊组3.46 mg/mL、己烯雌酚组0.002 3 mg/mL，按成人有效剂量给药。为便于配药，以上药物根据大鼠体重换算为0.02 mL/g控制给药量。每天灌胃1次，连续90天，至处死前24 h停止。

标本采集：处死前12 h禁食不禁水，10%水合氯醛0.8 mL腹腔注射麻醉，剖取双侧完整股骨，表面肌肉组织进行剔除分离，保留骨膜，标记右侧股骨，生理盐水浸泡过的纱布包裹，保鲜膜封存，恒温冷藏保存，以备检测骨密度(BMD)之用；摘取大鼠子宫，4 ℃室温4%甲醛溶液固定24 h，以备HE染色。

1.4 指标检测

1.4.1 右侧离体股骨骨密度测定 采用双能DIREX-10骨密度仪对PMOP大鼠的右侧离体股骨近段进行检测分析。显微CT扫描大鼠右侧股骨近心端，测量骨密度(BMD)、骨小梁体积/组织体积(BV/TV%)。

1.4.2 子宫不同部位病理学检测 取出固定好的子宫组织，经蒸馏水洗涤→酒精分梯度脱水→二甲苯透明→透蜡→石蜡包埋，改刀修整→切片机横切面连续切片为4 μm厚度→水浴锅展片→干净载玻片贴片→62 ℃烤片3 h→二甲苯脱蜡10 min、梯度酒精、蒸馏水、PBS缓冲液逐级复水→苏木精-伊红(HE)染色→中性树胶封片。

不同组PMOP大鼠各取5张切片(n0)，每张切片随机再选择5个视野(n1)，100倍倒置显微镜下对子宫内膜上皮细胞高度、子宫内膜腺上皮细胞高度、腺腔内径、宫内膜腺体面积百分比、肌全层(图2、表1、表2)变化情况进行观察，拍照后采用医学图像分析系统进行统计。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠体质量时序性变化

表1 各组大鼠造模成型期体质量变化

表2 各组大鼠灌胃治疗期体质量变化

表1显示：模型组与假手术组相比较差异显著(P<0.01)。表2显示：模型组与假手术组相比较差异显著(P<0.01)；蓝刺头高、中、低剂量组与假手术组相比较差别明显(P<0.05)；强骨胶囊组、己烯雌酚组与模型组相比较区别显著(P<0.05)；蓝刺头各剂量组、强骨胶囊组、假手术组之间比较差异不明显(P>0.05)。从整个实验的终末体质量变化来看，大鼠去卵巢后的体质量时序性变化均呈迅速增长，相比之下经阳性药物治疗后的各去势组大鼠体质量增长速度减缓，具有显著差异(P<0.01)，且蓝刺头剂量越大，大鼠体质量越轻，呈线性关系。

2.2 骨组织计量学变化

表3结果显示，与假手术组比较，各组大鼠股骨头近心端骨密度(BMD)、骨小梁体积/组织体积(BV/TV%)均下降(P<0.05)，其中模型组降低尤为明显 (P<0.01)；药物灌胃干预后，各给药组与模型组比较，BMD、BV/TV%均显著升高(P<0.05)；蓝刺头3剂量组之间比较，无统计学意义(P>0.05)，而与己烯雌酚组之间亦无统计学意义(P>0.05)。

表3 右侧股骨干骺端骨组织计量学结果比较

2.3 子宫不同部位病理学变化

表4、表5结果显示，与假手术组比较，模型组的子宫内膜上皮高度、腺上皮高度、腺腔内径厚度、内膜腺体面积均显著降低 (P<0.01)。 与模型组比较，蓝刺头中剂量组、强骨胶囊组、己烯雌酚组上述子宫组织各项指标均明显增加(P<0.05)，而三者之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

图2显示，假手术组内膜层较厚，内膜腺腔明显，全肌层较厚，细胞饱满，排列致密。与其相比，模型组大鼠子宫内膜层明显萎缩，内膜腺体面积减少，内膜上皮及腺体上皮高度减小；子宫腺腔内径厚度变薄，子宫腺减少；全肌层显著变薄，细胞缩小，排列松散。己烯雌酚组子宫内膜层无显著变薄，但上皮细胞水肿明显，部分腺上皮细胞排列不规则，内膜增生过快，尚未见病理恶变；蓝刺头组子宫内膜层虽比正常对照组有不同程度萎缩，但依然较厚，且无细胞水肿现象，差异有统计学意义(P<0.05)。

图2 PMOP大鼠假手术组和模型组子宫不同部位病理切片比较

表4 术后25周子宫内膜上皮细胞高度、子宫内膜腺上皮细胞高度变化

表5 术后25周子宫腺腔内径厚度、子宫内膜腺体面积百分比变化

3 讨论

雌激素在骨代谢中发挥着重要作用，女性绝经或摘除卵巢后，雌激素水平下降、缺乏会加速骨转换，促使骨形成和吸收偶联失衡，从而发生骨质疏松。而骨骼和子宫又是雌激素发挥作用的重要靶器官。骨密度(BMD)、骨小梁体积/组织体积(BV/TV%)是骨骼骨量和骨组织结构的主要评价指标，其中 BMD 为骨质疏松症的黄金诊断指标[7]。子宫是女性重要生殖器官之一和生育场所，存在雌孕激素受体；也是内分泌器官，可分泌前列腺素(PGE)、甲状旁腺激素相关蛋白(PTH-RP)、肿瘤坏死因子(TNF)、胰岛素样生长因子(IGF)等多种激素和细胞因子。综上，子宫对参与和调节机体骨代谢有重要意义。

有研究显示，肥胖会增加身体负重[8]，易导致骨折发生；且肥胖人群体内肌肉含量低，肌肉功能下降甚至受损，增加骨折风险。因此，控制体质量有助于预防骨质疏松。

在蒙医经典文献[9]中，骨质疏松属“骨枯症”范畴，其记载有“老年人赫依偏盛，体内三根、七素平衡失调，精华分解、吸收与排泄功能紊乱，导致骨之精华吸收减少，易骨枯”。而刺头是道地的野生传统蒙药材，在内蒙古各地随处可见，能够壮骨、接骨。

本实验显示在一定浓度范围内，蓝刺头能够明显上调去卵巢大鼠BMD、BV/TV%表达水平，从而起到一定的骨保护作用，据前期研究成果[10]推测蓝刺头可能是通过上调骨组织雌激素受体(ER)的表达而发挥类雌激素样作用；去势会提高大鼠体质量过快过高增长，会引发肥胖，蓝刺头能有效抑制体质量迅速增长，有助于预防骨质疏松，降低骨折发生风险，其可能也是通过经典雌激素通路实现的；蓝刺头能够提高子宫质量/体质量(UW/BW)、增加子宫内膜厚度、防止子宫内膜萎缩，延缓了子宫机能下滑状态，从而在骨量维持方面发挥重要作用。并且与阳性对照药物比较，蓝刺头组的子宫内膜厚度增长速度不及己烯雌酚组，与强骨胶囊组相比则无明显差异(P>0.05)，这一结果提示与西药己烯雌酚相比，蓝刺头的雌激素样副作用不明显，其发生子宫内膜癌的风险性可能降低。因此，蓝刺头在防治PMOP的同时，可以有效避免雌激素替代疗法给子宫带来的严重不良影响。

综上，蓝刺头可以对大鼠去卵巢后引发的骨量丢失、体质量过快过高增长和子宫功能衰退起到一定防治作用，证实蓝刺头有效性、安全性较高，并具有简(组方简单、给药量小)、效(有效成分清、效果一定)、验(理论、实验依据可靠)、廉(价低)优势，为应用传统民族医药理论防治绝经后骨质疏松症提供了一定实验依据。