淫羊藿苷激活抑制鼻咽癌CNE-2细胞存活、侵袭、迁移的体内外研究

魏璐璐， 吉文伟， 黄维平

（1.河南省南阳市中心医院耳鼻喉一病区，河南南阳 473000；2.河南省南阳市中心医院胆道普外科，河南南阳 473000）

鼻咽癌是耳鼻喉科常见的恶性肿瘤，起源于鼻咽部上皮细胞[1]，受多种因素影响，好发于我国南方地区，目前以手术、放射治疗为主要手段[1-2]。尽管手术、放射治疗延缓了部分患者的肿瘤发展进程，但仍有30%～60%的患者出现局部复发和/或远处转移[1，3]，因此，寻找增强鼻咽癌敏感性的治疗手段，减少肿瘤转移，改善其预后是亟待解决的问题。中药因其天然、易得、安全被医学界广泛关注。淫羊藿为小檗科植物箭叶淫羊藿Epimediumsagittatum（Sieb.et Zucc.）Maxim.或淫羊藿E.brevicornumMaxim.等的全草，味辛，性温，入肝、肾经，具有补肝肾、强筋骨、助阳易精、祛风除湿的功效[4]，可治疗老年慢性气管炎、风湿痹痛、阳痿、早泄等病症。淫羊藿苷（icariin）是其主要活性成分之一，具有抗骨质疏松、抗炎、抗氧化、抗抑郁等广泛的药理学作用[4-6]。近年来，有研究[4-7]表明，淫羊藿苷表现出广谱的抗肿瘤作用，包括食管癌、卵巢癌、肝癌、乳腺癌、成神经管细胞癌等。为进一步观察淫羊藿苷对鼻咽癌的抑制作用，本研究以鼻咽癌CNE-2细胞为研究对象，探讨不同浓度淫羊藿苷对鼻咽癌CNE-2细胞体内外存活及侵袭迁移的影响及机制，以期为淫羊藿苷临床治疗鼻咽癌提供实验数据，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1药物及配制淫羊藿苷（批号：P0057；分子式：C33H40O15；分子量：676.66；纯度≥98%）购自上海纯优生物科技有限公司。用二甲基亚砜（DMSO）配制成1 mol/L母液，使用时用细胞培养基对应稀释。

1.2主要试剂RPMI 1640培养基、胎牛血清、胰酶（美国Gibco公司）；细胞计数试剂盒8（CCK-8）（江苏凯基生物技术股份有限公司）；链霉亲和素-过氧化物酶（SP）染色试剂盒（上海翊圣生物有限公司）；血管内皮生长因子（VEGF）、上皮钙黏附蛋白（E-cadherin）、神经性钙黏附蛋白（Ncadherin）、波形蛋白（Vimentin）、Ca2+/钙调蛋白依赖性的蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）、磷酸化CaMKⅡ（p-CaMKⅡ）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）、磷酸化JNK（p-JNK）等单克隆抗体（美国Abcam公司）；辣根过氧化物酶标记的免疫球蛋白（IgG）抗体（美国Santa Cruz公司）。

1.3主要仪器电泳仪、半干转膜仪（美国伯乐公司）；Gel View 6000化学发光凝胶成像系统（广州云星仪器有限公司）；Transwell小室（北京优尼康生物技术有限公司）；普通光学显微镜（日本奥林巴斯公司）。

1.4体外研究

1.4.1 细胞来源及培养 人鼻咽癌CNE-2细胞，购自北京中国科学院肿瘤细胞库。以含有体积分数10%胎牛血清和1%青-链霉素的RPMI 1640培养基于37℃、体积分数5%CO2的恒温培养箱中培养。当细胞融合率达到80%以上时进行消化传代。

1.4.2 CCK8法测定细胞增殖能力 将鼻咽癌CNE-2细胞接种于96孔板，2×105个/mL。细胞贴壁后，按淫羊藿苷终浓度（0、0.1、0.25、0.5、1、2.5、5、10、20、50、100、200、300、400μmol/L）分组，再分别给予对应处理，每组设5个复孔。24 h后，每孔加入10μL CCK8溶液，继续孵育4 h，用酶标仪测定450 nm波长处的各孔吸光度（OD），计算CNE-2细胞存活率。细胞存活率=（OD加药-ODPBS）/（OD对照-ODPBS）×100%。根据细胞存活率的结果选择低细胞毒性的剂量进行后续实验。

1.4.3 划痕实验观察细胞迁移能力 在12孔板背面用记号笔画出5条平行直线，高温灭菌后备用。将CNE-2细胞以1×105个/mL的密度接种于上述12孔板中。细胞贴壁后，用10μL枪头垂直于培养板背面的横线划痕，用PBS清洗3次。根据“1.4.2”结果将细胞分为4组，分别为空白对照组（淫羊藿苷0μmol/L），淫羊藿苷10、20、50μmol/L组，培养24 h。随机选取5个视野，观察CNE-2细胞迁移情况。

1.4.4 Transwell实验观察细胞侵袭能力 分组同“1.4.3”项。将CNE-2细胞传代接种于提前用Matrigel基质胶包被的Transwell小室上层，细胞密度为1×105个/mL，用不含胎牛血清的培养液培养，Transwell小室下层则加入正常细胞培养液。继续培养24 h后，用无菌棉签拭去Matrigel基质胶和小室上层细胞，洗涤后用40 g/L多聚甲醛固定小室，再用结晶紫将迁移至小室下层的CNE-2细胞染色，流水冲洗去除多余染料并晾干。显微镜下每组随机选取5个视野对染色细胞进行计数统计。实验至少重复3次，每组设6个复孔。

1.4.5 蛋白免疫印迹法检测细胞VEGF、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、CaMKⅡ、p-CaMKⅡ、JNK、p-JNK蛋白表达水平 将CNE-2细胞传代接种于6孔板中，培养24 h后，分组同“1.4.3”项，加入不同浓度的淫羊藿苷，继续培养24 h后收集各组细胞。用添加蛋白抑制剂的放射免疫沉淀分析（RIPA）蛋白裂解液于冰上裂解细胞后，提取总蛋白，于4℃离心收集，取上清，用二喹啉甲酸（BCA）试剂盒进行蛋白定量。每组取等量蛋白质用12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）分离蛋白后，转移蛋白质到聚偏氟乙烯（PVDF）膜。用50 g/L脱脂奶粉室温封闭蛋白质2 h后，加入“一抗”VEGF抗体，于4℃孵育过夜。弃去一抗，加入辣根过氧化物酶标记的对应“二抗”IgG抗体，室温孵育1 h。滴加电化学发光（ECL）液于暗室曝光、显影，最后分析电泳条带的灰度值进行比较，以GAPDH为内参。E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、CaMKⅡ、p-CaMKⅡ、JNK、p-JNK蛋白的检测方法同上。

1.5体内研究

1.5.1 鼻咽癌CNE-2荷瘤裸鼠模型的构建与给药 5周龄BALB/c裸鼠60只购自北京维通利华实验动物公司（动物质量合格证号：11400700107330），适应性喂养1周后进行实验。于裸鼠右腋皮下接种鼻咽癌CNE-2细胞悬液0.2 mL（2×106个细胞）构建鼻咽癌模型。每天观察裸鼠一般状况及移植瘤生长情况。5 d后观测到成瘤后，将鼻咽癌裸鼠随机分为模型组和淫羊藿苷低、中、高剂量组。淫羊藿苷低、中、高剂量组分别腹腔注射淫羊藿苷10、20、50 mg/kg[12]，模型组给予等量基质液腹腔注射，每天给药1次，连续给药2周。自给药后开始计算，连续饲养裸鼠30 d，每天记录裸鼠的存活情况。给药结束后，每组随机抽取5只裸鼠摘取肿瘤组织并称质量。

1.5.2 末端脱氧核苷酸转移酶介导的d UTP缺口末端标记（TUNEL）法检测肿瘤组织细胞凋亡情况 将移植瘤组织制作成4μm厚度的石蜡切片，再进行TUNEL染色。显微镜下随机选取5个不同视野，计算每个视野细胞凋亡率。细胞凋亡率=凋亡细胞数/总细胞数×100%，取平均数。

1.5.3 免疫组织化学法检测移植瘤组织中VEGF表达水平和微血管密度（MVD）取移植瘤组织石蜡切片，严格按照SP染色试剂盒说明书进行免疫组织化学染色，用3，3’-二氨基联苯胺（DAB）试剂盒显色，苏木素复染，盐酸酒精分色，于光学显微镜下观察VEGF的表达情况。免疫组织化学染色阳性的细胞核呈棕色颗粒沉着。显微镜下随机选取5个不同视野，计算每个视野的阳性细胞率，阳性细胞率=阳性细胞/总细胞数×100%，取平均数。MVD值：参照Weidner法[13]，随机选取5个不同视野，观察并记录血管数目，计算单位面积的微血管数（条），取其平均数。

1.6统计方法采用SPSS 17.0统计软件对所有实验数据进行分析，数据以均数±标准差（x±s）表示。多组比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1淫羊藿苷对体外培养CNE-2细胞增殖能力的影响图1结果显示：随淫羊藿苷浓度的增加，CNE-2细胞存活率逐渐降低，从10μmol/L开始下降趋势明显，100μmol/L及以上浓度时CNE-2细胞存活率与空白对照组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。表明淫羊藿苷可剂量依赖性地降低人鼻咽癌CNE-2细胞的增殖能力，而当终浓度达到100μmol/L时出现明显的细胞毒性作用，故采用低细胞毒性的10、20和50μmol/L剂量进行后续实验。

图1 淫羊藿苷对CNE-2细胞增殖能力的影响Figure 1 Effect of icariin on the survivalability of CNE-2 cells

2.2淫羊藿苷对体外培养CNE-2细胞侵袭、迁移能力的影响图2-A1、A2结果显示：与空白对照组比较，淫羊藿苷10、20、50μmol/L组的侵袭细胞数均明显减少（P<0.05），且呈浓度依赖性。图2-B1、B2结果显示：与空白对照组比较，淫羊藿苷10、20、50μmol/L组的细胞划痕愈合率均明显下降（P<0.05），且呈浓度依赖性。表明淫羊藿苷可剂量依赖性地降低CNE-2细胞的侵袭迁移能力。

图2 淫羊藿苷对CNE-2细胞侵袭迁移的影响Figure 2 Effects of icariin on the invasion and migration of CNE-2 cells

2.3淫羊藿苷对体外培养CNE-2细胞上皮间质转化的影响图3结果显示：与空白对照组比较，淫羊藿苷10、20、50μmol/L组肿瘤转移相关蛋白VEGF、间质标记物N-cadherin和Vimentin的表达水平明显降低（P<0.05），而上皮标记物E-cadherin的表达水平明显升高（P<0.05），均呈剂量依赖性。

2.4淫羊藿苷对体外培养CNE-2细胞CaMKII、JNK磷酸化水平的影响图4-A1、A2、A3结果显示：与空白对照组比较，淫羊藿苷10、20、50μmol/L组CaMKII、JNK的磷酸化水平逐渐升高，差异均有统计学意义（P<0.05），且呈浓度依赖性。

图4-B1、B2结果显示：单独应用10μmol/L JNK抑制剂SP600125预处理细胞后，JNK的磷酸化水平较空白对照组明显降低（P<0.05）；单独用10μmol/L淫羊藿苷处理细胞时，JNK磷酸化水平较空白对照组明显上调（P<0.05）；而SP600125与淫羊藿苷联用时，JNK的磷酸化水平较单独SP600125预处理时明显增强（P<0.05）。表明淫羊藿苷可减弱JNK抑制剂SP600125对CNE-2细胞JNK磷酸化的抑制作用。

图4 淫羊藿苷对CNE-2细胞CaMKⅡ、JNK磷酸化水平的影响Figure 4 Effects of icariin on the phosphorylation levels of CaMKⅡand JNK in CNE-2 cells

2.5淫羊藿苷对鼻咽癌裸鼠体内成瘤的影响图5-A、B、C结果显示：与空白对照组比较，淫羊藿苷各剂量组鼻咽癌裸鼠存活率增加，移植瘤质量降低（P<0.05），且呈剂量依赖性。

图5-D1、D2结果显示：与空白对照组比较，淫羊藿苷各剂量组鼻咽癌裸鼠移植瘤组织细胞凋亡水平明显升高（P<0.05），且呈剂量依赖性。

图5-E1、E2结果显示：与空白对照组比较，淫羊藿苷20、50 mg组移植瘤组织VEGF阳性细胞数显著减少，且有剂量依赖性。

图5-F结果显示：与空白对照组比较，淫羊藿苷各剂量组MVD值明显降低（P<0.05），且呈剂量依赖性。

图5 淫羊藿苷对鼻咽癌裸鼠体内成瘤的影响Figure 5 Effects of icariin on tumor growth of nude mice with asopharyngealcarcinoma

3 讨论

为探讨淫羊藿苷抑制鼻咽癌的潜力，本研究从体内外两方面进行了观察。结果显示，淫羊藿苷可抑制鼻咽癌CNE-2细胞、CNE-2荷瘤裸鼠移植瘤的增殖，并可改善鼻咽癌裸鼠的生存率，表明羊藿苷可有效治疗鼻咽癌。

具有局部浸润和远处转移的能力是恶性肿瘤最主要的生物学特性，并且是导致患者死亡的最主要原因。肿瘤细胞通过上皮间质转化获得耐药性、干性和侵袭迁移能力，最终导致肿瘤的复发和转移。上皮间质转化是其中肿瘤细胞获得侵袭迁移能力的诱导性事件，其分子表现为上皮间质转化相关蛋白中的N-cadherin和Vimentin下调，E-cadherin上调，从而促进细胞上皮间质转化和迁移[8]。诱导肿瘤血管新生的能力是恶性肿瘤生长、浸润与转移的前提之一。VEGF是最重要的血管生长促进因子，并与多种肿瘤的恶性度及转移关系密切[9]。因此，抑制肿瘤的上皮间质转化以及增殖和侵袭迁移是肿瘤病情控制的关键[10]，是抗癌药的重要作用靶点。本研究结果显示，淫羊藿苷能剂量依赖性地抑制体外培养的鼻咽癌CNE-2细胞侵袭数目和划痕愈合率，调节上皮间质转化相关蛋白表达，抑制其体内肿瘤生长和VEGF在肿瘤组织中的表达，表明淫羊藿苷可抑制鼻咽癌CNE-2细胞的侵袭迁移能力。

CaMKⅡ是一种多功能丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，JNK是丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路的一个重要分支，它们在细胞周期、凋亡和应激等生理和病理过程中起着重要作用。当细胞内Ca2+稳态被破坏时，蓄积的Ca2+与钙调素相结合形成复合物启动CaMKⅡ的磷酸化，而激活后的CaMKⅡ能进一步导致JNK的活化，随后启动线粒体依赖的细胞凋亡[11-12]。活化的JNK进而激活上皮间质转化相关基因的转录因子，促进上皮间质转化和后续侵袭迁移过程[13]。Ca2+稳态的失调是包括鼻咽癌在内肿瘤中上皮间质转化发生的关键促进因素[14]。而与Ca2+稳态相关的JNK是鼻咽癌进展和侵袭的重要促进因素[15]。本研究结果表明，淫羊藿苷能激活CaMKⅡ/JNK信号通路，并部分抵消JNK抑制剂SP600125对该通路激活的抑制作用，从而实现对鼻咽癌CNE-2细胞存活和转移的抑制作用。

综上所述，本研究以人鼻咽癌CNE-2细胞为研究对象，初步探讨了淫羊藿苷在体内外实验中对CNE-2细胞存活和转移的影响及其机制。结果表明，淫羊藿苷可抑制鼻咽癌CNE-2细胞的存活和转移特性，其机制可能与激活CaMKⅡ/JNK信号通路有关。本研究初步阐明了淫羊藿苷抗鼻咽癌CNE-2细胞的机制，为淫羊藿苷在临床治疗上的应用提供了一定参考。