猪肠源粪肠球菌的体外耐受性研究

黄显晔，谢宇庭，张鹏宇

（1. 黑龙江省大庆市杜尔伯特县畜牧技术服务中心，黑龙江 大庆 163000；2. 黑龙江省齐齐哈尔市畜牧总站，黑龙江 齐齐哈尔 161006；3. 黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院，黑龙江 齐齐哈尔 161000）

益生菌是调节宿主肠道菌群平衡的重要微生物，近年来成为研究的热点，多项研究表明益生菌具有维持肠道菌群平衡、抑制致病菌繁殖、提高机体免疫力，降低腹泻率及促进饲料消化吸收等功能。2019 年农业农村部发布的第194 号公告，鼓励企业和研发机构加快开发生物饲料、酶制剂、益生菌、植物提取物等抗生素替代产品，促进畜牧业抗生素减量替代，确保畜禽产品质量安全，其中益生菌在畜牧兽医行业中具有巨大的应用前景。

本试验用粪肠球菌由仔猪直肠分离得到，经过相关鉴定及试验已确定其为益生菌，通过本次体外耐受性试验，验证其是否耐酸、耐胆盐及耐高温，为进一步研制微生态制剂提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验菌株 粪肠球菌(Enterococcus faecium)DM-F16 由大庆市某猪场仔猪直肠内容物分离获得。

1.2 试剂及设备 LB 固体培养基、LB 肉汤培养基（山东拓普生物工程有限公司）、猪胆盐（索莱宝科技有限公司）；立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）、立式小容量恒温培养摇床（上海世平实验设备有限公司）、洁净工作台（北京东联哈尔仪器制造有限公司）。

1.3 菌液制备 用无菌接种环挑取少量试验菌株于LB 平板培养基上，划线，37℃温箱培养24h，挑取单一菌落，接种到LB 肉汤培养基中，37℃培养至对数生长期后平板计数，取用菌液浓度为1.2×108cfu.mL-1。

1.4 粪肠球菌体外存活率计算 参考文献方法[7]以下列公式进行计算粪肠球菌体外存活率。

1.5 菌株耐酸性试验 用浓盐酸调节已配制好的LB 肉汤培养基，pH 值分别为2.0、3.0、7.0。

按2%的量接种菌液，37℃，180r.min-1摇床内培养，分别于1h、2h 和3h 取样100μL 进行平板计数，并计算粪肠球菌体外存活率。

1.6 耐胆盐试验 菌种分别接种于含猪胆盐为0.1%、0.2%、0.3%、0.5%LB 肉汤培养基中，接菌量为体积的2%，然后置于180r.min-1摇 床 内37℃培 养，于1h、2h、4h 和8h 取 样100μL，平板计数及计算粪肠球菌体外存活率。

1.7 高温耐受试验 取试验菌液分别置于试管中，在37℃、50℃、60℃、80℃下水浴，分别于培养的第3min、10min、15min、30min 取样100μL，平板计数及计算粪肠球菌体外存活率。

2 结 果

2.1 耐酸性试验结果

粪肠球菌DM-F16 耐酸性试验结果如表1 所示，在pH是2.0 培养基中，随着时间的延长粪肠球菌的存活率明显下降，当培养3h 后菌浓度下降一个数量级，存活率仅有2%左右，在pH 值为3.0 和7.0 的浓度下存活率随着时间的延长逐渐增大，可推断出该菌株对pH 为3.0 以上的酸度环境生长适应良好。

表1 粪肠球菌DM-F16 对不同pH 的体外存活率（%）

表2 粪肠球菌DM-F16 对不同浓度胆盐的体外存活率（%）

2.2 耐胆盐试验结果

粪肠球菌DM-F16 的耐胆盐试验结果如表2 所示，胆盐浓度在0.1%～0.2%能很好的生长，在浓度0.3%时随着培养时间延长，存活率有所下降，在培养8h 后存活率仅为75.65%，说明菌株对该浓度胆盐有一定的耐受性，但在含0.5%胆盐的培养基中，培养8h 后存活率下降了90%，说明菌株对高浓度胆盐缺少耐受性。

表3 粪肠球菌DM-F16 对不同温度的体外存活率（%）

2.3 高温耐受试验结果

如表3 结果所示，菌株DM-F16 在不同温度下培养，37℃培养随时间延长正常生长，在50℃存活率逐渐下降，培养30min 后取样发现存活率为46.76%，60℃高温下培养30min 存活率仅为21.09%，说明该菌株对高温敏感。

3 讨 论

粪肠球菌（Enterococcus faecalis）属于革兰氏阳性菌，在人和动物的肠道中广泛存在，粪肠球菌具有很多毒力因子，可引起胃肠道、口腔及泌尿道等感染，另一方面该菌可产生细菌素等物质抑制其他病原菌繁殖从而改善宿主肠道微环境，亦可抑制肠道中产尿素酶细菌和腐败菌的繁殖降低内毒素及血氨含量，有研究表明粪肠球菌具有较强上调肠上皮细胞SERTmRNA 和蛋白表达的作用能够增加5-HT 的再摄取从而减弱胃肠道症状；因此筛选具有益生菌特性的粪肠球菌菌株并研制相关微生态制剂，其安全性、益生菌样功能及菌株的体外耐受性是很重要的考察指标；其中体外耐受性主要是模拟菌体通过动物胃肠道，对胃肠道环境适应性、制成微生态制剂过程及成品运输中对外界环境的抵抗能力。

本试验菌株来源于仔猪，将主要研制成仔猪用微生态制剂，因此需要考虑仔猪肠道环境的特殊性，消化道是个复杂的环境，尤其仔猪断奶后一段时间内消化道环境较育成猪的变化更多：胃内的pH 值从断奶前的pH4.0 左右到断奶后升高至pH5.5 左右，然后开始下降，仔猪60 日龄后渐渐达到成猪的pH3.0 左右；而肠道内的酸度逐渐降低达到中性偏碱性，其中起主要作用的是胆汁，浓度大约在0.03%～0.3%，试验模拟肠道中胆汁浓度进行菌株的耐胆盐能力考查；在高温试验中主要是针对制剂过程中加热温度的考察，是否能够耐受一定的高温，本试验菌株对高温敏感，因此在研制微生态制剂过程中是重要的影响因素。

本试验所用菌株由仔猪直肠分离得到，已通过其培养特征、菌落及菌体形态观察、生理生化鉴定以及16SrDNA 序列分析已确定为粪肠球菌，又经过一系列安全试验及益生菌特性试验已确定其安全性及具有益生菌作用。经过耐酸、耐胆盐、耐高温试验，结果表明分离的粪肠球菌具有较好的耐酸性及耐胆盐能力，但对高温敏感，试验结果为进一步研制益生菌制剂提供了可靠数据。