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电针对脑缺血再灌注损伤小鼠Bcl-2和Bax表达的影响*

2021-05-21何金川谢文霞程芳芳杨梦瑶

浙江中医杂志 2021年5期
关键词:暗带脑缺血电针

叶 伟 何金川 谢文霞程芳芳 杨梦瑶 马 瑶

温州医科大学附属第一医院 浙江 温州 325000

中风具有发病率高、死亡率高、致残率高的特点[1]。脑缺血再灌注损伤(CIRI)的细胞凋亡是导致神经细胞死亡的主要途径之一[2]。细胞凋亡过程中Bcl-2和Bax基因起着重要的调控作用,它们之间的平衡决定了凋亡诱导[3],Bcl-2为STAT3的下游靶因子,STAT3通过调节下游靶蛋白的表达从而在抗凋亡方面发挥作用。笔者在先前的研究中发现电针“百会”“内关”可以迅速激活脑内JAK2/STAT3信号通路,减少脑梗死体积,改善CIRI后小鼠的神经功能[4]。随后亦对Bcl-2及Bax表达影响作了进一步研究,现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组:SPF级C57BL/6N小鼠60只,体质量18~20g,年龄6~8周。饲养于温州医科大学附属第一医院动物实验中心。饲养环境:温度23~25℃,湿度60%~80%,人工光照12h:12h明暗交替。予以自由饮食与饮水。实验过程中对动物的处置符合2006年科技部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》规定。小鼠适应性喂养1周后,采用随机数字表法将所有小鼠分成3组:假手术组、对照组、电针组,每组20只。各组再分2h、8h、24h、7d四个亚组,每亚组各5只。

1.2 主要试剂和仪器:麻醉剂水合氯醛;2,3,5-三苯基氯化四氮唑、4%多聚甲醛溶液购自Solarbio公司;Bcl-2、Bax、P-JAK2、P-STAT3、β-actin-抗和碱性磷酸酶标记山羊抗兔均购自美国CST公司。电泳槽、转膜仪均购自美国Bio-rad;37℃恒温箱;超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司);华佗牌SDZ-ⅡB电针仪电子针疗仪;佳辰牌针灸针具(江苏省吴江市佳辰针灸器械有限公司)。

1.3 小鼠MCAO模型制作:术前动物禁食24h,自由饮水。采用改良的Longa法制备MCAO小鼠模型,在1.5h后,拔出线栓,使动脉血流再灌注。整个实验过程中注意小鼠保暖。小鼠苏醒后,采用Longa的5分制法进行评定,1~3分为动物缺血模型建立成功的标志。没有神经病理症状或者神经病理症状不明显的予以去除,用同一批次组别的小鼠制成合格模型后凑足数目。

1.4 干预方法:假手术组:小鼠接受相同的麻醉操作与模型组一样的各项手术操作,但只进行动脉分离的操作,不插入线栓,不给予电针干预。模型组:采用改良Longa线栓法制备,缺血1.5h后拔出线栓,模型建立后不进行任何干预处理,不给予电针干预。电针组:建立模型,缺血1.5h后拔出线栓再灌注。造模成功后将小鼠固定在筒形小鼠固定器上,暴露小鼠前肢、头部,参照郭义主编《实验针灸学》的择穴方法取“百会”“内关”(患侧)。使用0.16mm×13mm毫针,“百会”穴沿皮平刺2mm,“内关”穴直刺0.3mm。选用SDZ-ⅡB型华佗牌电针仪进行电刺激,疏密波,频率2/15hz,强度1mA,以小鼠安静且穴周组织轻微抖动为度。第一次电针在小鼠造模后1小时立即开始,以后每天1次,每次30min,直到处死小鼠的那一天。

1.5 检测指标及方法:Bcl-2、Bax蛋白表达含量测定(Western Blot):于再灌注后2h、8h、24h、7d各相应时间点,分别取5只小鼠麻醉后,迅速处死,电针组和模型组取缺血侧半暗带,假手术组取同侧皮质。各组取适量组织加入组织裂解液混合物,冰上采用超声波(80W)粉碎组织,随后离心取上清液,用BCA法测量蛋白含量,样品变性后行10%SDS-PAGE凝胶电泳,操作完毕后马上进行转膜,然后用3%BSA封闭1小时,封闭后切下P-JAK2蛋白、P-STAT3蛋白、BCL-2蛋白、BAX蛋白、β-actin对应条带,对应一抗孵育过夜,TBST清洗加室温二抗孵育,TBST清洗。将膜用ECL发光显色液曝光,拍照保存。用Image J测量各条带灰度值,并将目标蛋白灰值和内参灰度值的比值作为其相对表达量,进行各组的对比。

1.6 统计学分析:采用SPSS 25.0软件包对数据进行处理、分析,计量资料以均数±标准差(±s)表示,二分类资料采用最小显著差值法(LSD)比较,多分类资料采用单因素方差分析,以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

各组MCAO小鼠缺血灶半暗带区Bcl-2/Bax比值比较如图1所示。假手术组的Bcl-2/Bax比值,7天内表达平稳,组内比较无统计学意义(P>0.O5);与其他两组对比,在各个时间点相比偏低(P<0.O1)。模型组、电针组的变化趋势相同:在I/R后2h开始升高,I/R后8h达高峰(P<0.O1),随后下降;在I/R后7d比值最低(P<0.O1);电针组与模型组组间比较,I/R后8h、24h Bcl-2/Bax比值电针组均高于模型组(P<0.O1、P<0.O5);I/R后7d低于模型组(P<0.O5)。

图1 各组MCAO小鼠缺血灶半暗带Bcl-2/Bax比较图

3 讨论

电针治疗缺血性中风是临床上行之有效的方法之一[5],许多研究发现缺血前给予单次或多次的电针治疗,可以诱导脑缺血耐受,降低缺血后再灌注损伤的程度,改善各种功能障碍,起到预防及治疗脑神经损伤的作用。百会穴是手足阳经、督脉等多经交会的部位,全身经脉之气汇聚之所,为古今医家治疗脑病之要穴;内关为手厥阴心经的络穴,又是八脉交会穴之一,通于阴维脉,具有宁心定智、宽胸理气、活血通络止痛之功效,是针灸防治心脑疾病的首选穴。百会穴、内关穴配合被广泛用于治疗中风等临床疾病。

有研究发现[6]脑缺血再灌注可诱发细胞凋亡,大鼠全脑I/R后,缺血2h再灌注0.5h,缺血区有较多的凋亡细胞;再灌注12h,凋亡细胞数量达高峰。因此我们选择小鼠造模后1小时立即进行电针干预,并在前期实验[4]中于I/R后不同时间点动态观察I/R后梗死体积、PJAK2和P-STAT3表达变化规律,发现电针组的P-JAK2、P-STAT3水平于I/R后2h迅速升高,在I/R后8h、24h远远高于模型组与假手术组;同时,I/R后24h、7d各相应时间点,电针组梗死体积明显小于模型组与对照组,证实电针组的细胞凋亡程度低于模型组。

Bcl-2和Bax是一对功能上相对的凋亡调控基因,Bcl-2是抗凋亡基因,可阻止许多因素所诱导的细胞凋亡,而Bax是促凋亡基因,Bax蛋白不但拮抗Bcl-2的抑制凋亡作用,而且有直接促进细胞凋亡的功能;它们是JAK2/STAT3信号通路的下游靶因子,在抗凋亡、减轻炎症反应等方面发挥作用。本次实验中,I/R后,电针组小鼠脑组织半暗带区Bcl-2表达减弱,但Bax的表达更少,因此Bcl-2/Bax比值反而逐步上升,到24 h达到高峰,且每个时间段的比值高于模型组。推测电针虽然抑制了Bcl-2,但同时更强烈抑制Bax的表达,使Bcl-2/Bax比值上升达到抗凋亡作用;因此在I/R后24h、7d,电针组梗死体积明显小于模型组,提示电针有提高Bcl-2/Bax比值达到减轻CIRI的作用。结合前期的实验结果,推测电针可迅速加快JAK/STAT信号通路活化,促进半暗带中P-JAK2和P-STAT3的表达,增加Bcl-2/Bax比值,参与细胞抗凋亡及免疫调节等过程,这可能是针刺干预CIRI的部分作用机制。

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