超声引导下两种肝癌模型建立效果的比较分析

汪德兵， 杨鹏， 黄智， 许敏， 王黎洲， 周石

原发性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是临床常见恶性肿瘤，目前，随着诊疗技术进步，HCC早期检出率有所提高[1]，但有关HCC的发病机制仍尚未完全阐明，且多数患者确诊时肝脏储备功能降低，全身状态恶化，失去手术治疗机会[2]。因而，探索HCC早期病理特点对HCC治疗具有重要意义。而HCC建模是开展HCC基础研究的必然选择，兔VX2肝癌模型被认为与人类HCC病理特征相近[3]，而超声引导下经皮穿刺植瘤是目前临床常用HCC动物建模方法，但近年来有学者对其建模成瘤率和临床应用提出异议[4-5]。笔者对超声引导下肝癌模型建立的方法进行改良，对比分析两种建模方式的效果，报道如下。

材料与方法

1.实验动物、设备及试剂

选择40只清洁级新西兰白兔作为实验动物，另取1只荷瘤兔用于VX2肝癌肿瘤组织块悬液备制。白兔均由贵州医科大学动物中心提供，要求白兔体质量2.0～2.5 kg，雌雄不限。戊巴比妥钠粉剂购自中国医药集团，生产批号F20081216。戊巴比妥钠采用0.9%生理盐水配成3.0%溶液后使用。速眠新购自长沙拜特生物科技研究所有限公司，批准文号：兽药字180121777。超声诊断仪为Philips HD7型飞利浦彩色多普勒超声诊断系统。数字减影血管造影(digital subtraction angiography,DSA)采用日本东芝公司生产的INFFX 8000V型800毫安以上DSA造影机。

2.实验步骤

观察组实验步骤 ：①VX2肿瘤组织块悬液备制：对VX2荷瘤兔称重，一侧后腿肌注3%戊巴比妥钠1 mL/kg，另一侧肌注速眠新0.2 mL/kg。麻醉起效后，逐层剥离荷瘤兔后腿组织，暴露并切除肿瘤组织，洗净后置于无菌培养皿内，纵行切开肿瘤组织，用无菌剪刀将肿瘤标本剪成0.5 mm3瘤粒，按1:1比例将瘤粒与无菌生理盐水混匀，获得肿瘤组织悬液备用。②肝癌模型建立：取20只实验白兔，麻醉方法同VX2荷瘤兔，麻醉起效后，将白兔固定于实验板上，铺无菌巾，行肝脏超声扫描。在超声引导下，采用18G穿刺套管针在肝左叶内侧段膈面与外侧段脏面重叠处经皮进行肝脏穿刺，穿刺针穿入肝脏深度0.8～1.0 cm，在进针距体表1.5～2.0 cm，回吸无胆汁及血液后，退出针芯，留置穿刺鞘管，在超声引导监视下，经穿刺鞘管将0.3 mL肝癌肿瘤组织悬液缓慢注入肝组织内。完成后将明胶海绵条装于18G血管鞘前端，鞘管尾端接上头端装有凝胶海绵条的另一个穿刺鞘管，采用平头穿刺针芯将明胶海绵条推入前一个鞘管，取下尾端鞘管及针芯，再用平头针芯将明胶海绵条缓慢推入穿刺针道内(图1)，压迫止血30 s后放回动物箱内。③超声监测：在建模术后每周行1次超声检查，检查时选择线阵探头，频率8.0～12.0 MHz，行彩色多普勒超声检查，记录肝脏超声回声特点、肿瘤大小、形态。待肿瘤直径生长至2.5 cm时行DSA检查，全麻后将动物仰卧位固定，在右侧股动脉搏动最明显处做切口，暴露股动脉并结扎动脉远端，透视下配合Progreat微导丝将微导管经腹腔干引至肝总动脉，注入碘海醇造影剂1 mL行DSA检查，记录造影结果。术后结扎股动脉近端，缝扎切口。

图1 a) 超声引导下将0.3 mL肿瘤组织悬液经穿刺鞘管缓慢推入肝脏内；b)采用18G穿刺套管针穿刺，明胶海绵条装于18G血管鞘前段，明胶海绵进入穿刺针道后膨胀。 图2 尸检取出肝脏标本，见团块状瘤体，肝内种植成功。 图3 尸检取出肝脏标本，见肝周及网膜广泛结节灶，为肿瘤异位种植。

对照组实验步骤：对实验白兔行后腿肌注戊巴比妥钠2 mL/kg麻醉，麻醉起效后行超声检查，在超声引导监视下将0.3 mL VX2肿瘤组织悬液缓慢注入肝组织内。完成后退针，局部压迫止血30 s后放回动物箱内。建模术后每周行1次超声监测。两组均在建模术后正常喂养60 d，记录白兔死亡时间，喂养满60 d后处死白兔，并进行尸检，取肝脏病灶组织进行病理检测。

3.统计学分析

结 果

1.两组建模手术情况比较

观察组建模术中麻醉诱导时间较对照组显著缩短，术中白兔苏醒率显著低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。两组手术时间差异无统计学意义(P>0.05，表1)。

表1 两组建模术中情况比较

2.两组肿瘤种植结果

观察组白兔术中无死亡，对照组有2只死亡，均因术中麻醉苏醒未及时处理死亡。观察组术中死亡率低于对照组，但两组间差异无统计学意义(Fisher检验，χ2=0.487，P=0.244)。超声检查并经尸检结果证实，观察组17只肝内种植成瘤，2只肝外腹壁浸润，1只未发现瘤体，成瘤率为95%，异位种植率为10%，建模术后60 d内有1只建模成功白兔在术后第7周时死亡，存活19只，白兔建模术后60 d存活率为95%。对照组9只肝内种植成功，5只腹壁浸润，3只腹膜腔种植，1只未发现瘤体，成瘤率为85%，异位种植率为40%，建模术后60 d内有2只肝癌建模成功白兔在术后第6周时死亡，存活16只，存活率为80%。两组成瘤率差异无统计学意义(Fisher检验，χ2=0.605，P=0.302)，两组白兔建模术后60 d存活率差异无统计学意义(χ2=2.057，P=0.151)，两组异位种植率差异有统计学意义(χ2=4.800，P=0.028)。肿瘤种植结果见图2、3。

3.两组建模后超声监测结果

排除建模失败和建模术中死亡白兔，观察组19只和对照组17只建模成功。对建模成功白兔进行超声监测，结果显示两组术后2周、3周及4周时肿瘤病灶直径均显著大于术后1周，差异有统计学意义(P<0.05)。两组术后2周与术后3周的肿瘤直径差异无统计学意义(P>0.05)。术后4周观察组肿瘤直径显著大于对照组，差异有统计学意义(P<0.05，表2)。两组肿瘤病灶被首次超声检查发现时均以等回声表现为主，待病灶直径生长至2.5 cm左右时行DSA造影多可见“抱球征”(表3，图4)。在术后3周时可发现肿瘤坏死，病灶中心无回声，彩色多普勒超声检查提示无血流信号。肝脏内可见结节呈稍高回声、回声均匀(图5)。

图4 肝癌病灶DSA血管造影，可见肿瘤病灶直径约2.48cm，病灶动脉期异常染色、血供丰富，门静脉期病灶染色减退，瘤体呈“抱球征”。 图5 肝癌肿瘤超声表现。a) 肝脏内可见结节呈稍高回声、回声均匀；b) 可见无回声区。 图6 低倍镜下(×100)观察肝癌肿瘤细胞。 图7 高倍镜下(×400)观察肝癌肿瘤细胞。

表2 两组成瘤白兔术后直径比较 (cm)

表3 两组成瘤白兔超声及DSA造影表现特点 (n，%)

4.两组肿瘤病理结果

白兔死亡后取肝脏病变组织进行病理检查，病理结果显示成瘤白兔病变区域与周围正常组织边界欠清晰，可见癌巢样结构，肿瘤细胞排列紊乱,形态各异(图6、7)。两组共36只建模成功，肿瘤病理结果显示病灶直径为(3.92±0.41)cm，最后一次超声检查结果显示肿瘤直径为(3.93±0.38)cm;超声与病理结果差异无统计学意义(t=0.068，P=0.946)，两者具有良好的一致性(r=0.993，P=0.000)。

讨 论

建立良好的肝癌动物模型是开展基础实验的必要条件，VX-2肿瘤细胞株是源于Shope病毒诱发的兔乳头状瘤鳞癌，经72次移植传代后建立的瘤株。移植性VX-2白兔肝癌模型不仅具有与人类相近的组织分型和生物学行为，还可在肝脏、骨骼、肾脏及软组织等脏器种植生长，且肿瘤血管生长速度快，血供丰富[6-7]，这也为影像学研究创造了条件。因而，白兔作为肝癌动物模型在临床得到广泛应用。

经皮行肝穿刺与开腹穿刺接种相比，手术创伤小，术中死亡率低，重复性好[8]，本研究结果也显示两组仅对照组发生2只白兔术中死亡，与既往报道一致。本研究利用组织细胞悬液注入瘤株，可通过细胞计数保证细胞数量和浓度的一致性。术中良好的麻醉方案有助于降低动物术中苏醒率和实验动物死亡风险，戊巴比妥钠通过阻断脑干网状结构上行激活系统，抑制中枢神经[9-10]，发挥镇静和抗惊厥作用。本研究选用戊巴比妥钠，以肌注方式进行，这种方式可减缓药物吸收速率，有助于避免因一过性浓度过高导致白兔死亡[11]。但Kageyama等[12]认为单药麻醉效果有限，既往报道也显示单药麻醉术中动物苏醒率高，这成为建模术中重要的死亡原因[13]。本研究中对照组2只白兔均因麻醉意外死亡，与上述报道一致。速眠新是由ED-TA、DHE-HCL及氟哌啶醇组成的复方麻醉制剂，具有诱导期短、麻醉起效快等特点[14]。本研究在观察组中采用戊巴比妥钠与速眠新复合麻醉，两者可发挥协同作用，以缩短麻醉诱导时间，提高麻醉效果。本研究结果显示观察组麻醉诱导时间较对照组显著缩短，且术中苏醒率显著降低，说明复合麻醉较单一麻醉更有助于保证建模术的安全性。

本研究对建模术进行改良，在注入悬液后封堵穿刺道。本研究根据明胶海绵遇水膨胀原理[15]，将明胶海绵碾压呈条状，让前一个含有组织悬液的鞘管与另一个含明胶海绵条的鞘管头端完成对接，这可使明胶海绵进入穿刺针道后膨胀，从而防止肿瘤组织悬液外渗至肝周或腹腔，降低术后血肿和异位种植风险。另外，手术操作也与异位种植相关。兔肝体积左叶大于右叶，本研究选择肝左叶内侧段膈面与外侧段脏面重叠处作为穿刺点进行种植，肝左叶外侧段客观上起到阻隔作用，有助于防止腹壁和腹腔异位种植。此外，进针角度也影响肿瘤悬液细胞定植。进针角度应适宜，避免角度太大和进针太深，从而有效防止悬液沿针道逆行反流或穿透肝脏[16]，引起腹腔内广泛种植。因而，本研究推荐进针时穿刺针穿入肝脏深度以0.8～1.0 cm为宜。本研究结果显示观察组异位种植率显著低于对照组，与上述结论一致。

本研究结果显示两组白兔肿瘤均在术后2～3周时迅速生长，直径达到2～3 cm，与既往报道一致[17]。此时行超声和DSA检查既可避免病灶过小而显示不清，也可防止病灶过大而导致全身转移。超声和DSA检查可为肝脏介入治疗提供依据，已在临床广泛应用[18]。本研究结果显示超声与病理结果一致性较好，这提示超声可作为VX-2白兔肝癌模型的监测工具。本研究结果还显示对于首次发现与肿瘤坏死等不同阶段白兔肝癌模型的超声结果存在显著差异，提示超声检查可动态观察肿瘤生长情况，为判断肿瘤病理进程提供参考。另外，肿瘤生长至2～3cm时血管造影也可清晰显示“抱球征”，这不仅可为进一步明确肝癌肿瘤组织血供情况提供依据，还有助于下一步病理检查的开展。

综上所述，复合麻醉与针道封堵用于超声引导下肝癌建模术能显著提高手术安全性，彩色多普勒超声可作为动态监测建模术后肿瘤生长的影像学检查工具。