QPRT、miR-26b-5p在乳腺癌中表达及其与患者预后的关系

袁南贵，罗雪平，胡玉萍，姚斌，黄伟玲

乳腺癌是女性最为常见的恶性肿瘤之一，具有较高的发病率和病死率。2019年全世界发现乳腺癌约210万，严重威胁女性健康[1]。乳腺癌的发生发展受多种因素、多种方式共同影响，基于美国国家生物信息中心的GEO数据库中乳腺癌基因表达芯片显示，与甘油酯类、活性氮类及辅酶类代谢过程相关基因的差异性表达可能与乳腺癌预后有关[2]。其中，喹啉酸磷酸核糖基转移酶(quinolinic acid phosphoribosyltransferase，QPRT)是喹啉酸盐代谢中的关键酶，可能参与乳腺癌辅酶代谢过程，并且QPRT高表达提示乳腺癌患者较低生存率，与患者预后不良有关[2]。关于QPRT与乳腺癌患者临床病理参数的关系研究国内外鲜见报道。近年来，微小RNA(microRNA，miRNA)在恶性肿瘤中的作用越来越受到关注，通过靶向mRNA的3’非翻译区而抑制其靶基因的表达，参与肿瘤的增殖、分化、侵袭过程[3-4]。有研究发现，miR-26b-5p通过孕激素受体A亚型(progesterone receptor A，PR-A)受黄体酮激素调控，其表达水平与PR-A呈正相关，独立介导乳腺癌细胞的侵袭和转移[5]。因此，本研究通过检测乳腺癌组织中QPRT、miR-26b-5p表达水平，探究其与乳腺癌患者预后的相关性，讨论其潜在临床价值，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2015年3月—2017年10月于广州市中西医结合医院行乳腺癌改良根治术女性患者89例为观察组，经病理组织检查均为乳腺浸润性导管癌，年龄29～67岁，中位数49岁；绝经55例；肿瘤直径≥6 cm 52例，<6 cm 37例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期31例，Ⅲ～Ⅳ期58例；低分化程度62例，中、高分化程度27例；有淋巴结转移55例，无淋巴结转移34例。同时取癌旁正常乳腺组织为对照组。本研究获得医院伦理委员会批准同意，患者及家属知情同意并签署知情同意书。

1.2 病例选择标准 (1)纳入标准：①术前均未接受任何辅助化疗或内分泌治疗；②病理组织石蜡标本均保存完整；③临床资料完整。(2)排除标准：①合并其他肿瘤；②合并免疫缺陷、传染性疾病；③因各种原因拒绝参与本研究者。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 免疫组化法检测QPRT表达水平：乳腺癌改良根治术后，将乳腺癌组织做成石蜡标本，连续切片厚度4 μm，进行脱蜡处理，采用链霉亲合素—生物素复合物(SP)法染色，方法步骤严格按照试剂盒说明书进行。一抗采用兔anti-QPRT单克隆抗体试剂盒(购自上海爱必信生物科技有限公司)按照1∶50稀释，组织切片与一抗在4℃过夜，随后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗兔IgG(1∶200，购自美国Abcam公司)孵育1 h，再加入SP孵育30 min，将每个切片在二氨基联苯胺(DAB)工作液500 μl中室温下浸泡3～10 min，苏木素复染，脱水、透明、封片。用磷酸盐缓冲液作为阴性对照。结果判定标准：(1)按染色强度记分，无染色为0分，浅黄色为1分，黄色或黄棕色2分，棕褐色为3分；(2)按阳性细胞百分比记分，无阳性细胞记0分，阳性细胞<25%记1分，25%～50%记2分，51%～75%记3分，>75%记4分。取2种方法得分的乘积，乘积0分为阴性(-)，1分为弱阳性(+)，2～3分为阳性(++)，>3分为强阳性(+++)；同时定义>3分为高表达，≤3分为低表达。

1.3.2 原位杂交技术检测miR-26b-5p表达水平：石蜡切片经梯度脱蜡后利用3%双氧水在室温下浸泡10 min，蒸馏水清洗3遍，按照试剂盒说明书方法进行原位杂交，置于光学显微镜(德国徕卡公司，型号DM1000)观察。 结果判定标准：(1)按染色强度，无染色或浅黄色颗粒为1分，黄色或黄棕色颗粒为2分，棕褐色颗粒或团片状为3分；(2)按阳性细胞百分比记分：无阳性细胞记0分，阳性细胞<10%记1分，10%～50%记2分，>50%记3分。取2种方法得分的乘积，乘积0分为阴性(-)，1分为弱阳性(+)，2～3分为阳性(++)，>3分为强阳性(+++)；同时定义>3分为高表达，≤3分为低表达。

1.3.3 记录随访情况：患者术后即进行规范的后续治疗并进入随访观察，每3个月进行一次电话或门诊随访，观察记录患者3年内复发、转移情况。

2 结 果

2.1 乳腺癌组织与正常乳腺组织QPRT、miR-26b-5p表达比较 QPRT主要定位于细胞核和细胞质，miR-26b-5p主要定位于细胞质，见图1、2。乳腺癌组织中QPRT表达(-)16例(17.98%)，(+～++)34例(38.20%)，(+++)39例(43.82%)，其阳性表达率82.02%，明显高于癌旁正常乳腺组织的26.97%(χ2=54.395，P=0.000)；乳腺癌组织中miR-26b-5p表达(-)43例(48.32%)，(+～++)29例(32.58%)，(+++)17例(19.10%)，其阳性表达率51.68%，明显低于癌旁正常乳腺组织的85.39%(χ2=23.448，P=0.000)，见表1。

表1 QPRT、miR-26b-5p在乳腺癌组织与正常乳腺组织中的表达比较 [例(%)]

图1 QPRT在乳腺癌组织中的表达情况(免疫组化染色，×400)

图2 miR-26b-5p在乳腺癌组织中的表达情况(原位杂交技术， ×400)

2.2 QPRT、miR-26b-5p在乳腺癌组织中表达的关系 利用Spearman分析乳腺癌组织中QPRT、miR-26b-5p表达关系，结果显示二者表达呈负相关(r=-0.343，P=0.000)。

2.3 QPRT、miR-26b-5p在不同临床/病理特征中表达水平比较 在乳腺癌组织中QPRT、miR-26b-5p高低表达水平在不同年龄、是否绝经、肿瘤直径中比较，差异无统计学意义(P>0.05)，在不同TNM分期、肿瘤分化程度、淋巴结转移情况中比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 乳腺癌组织QPRT、miR-26b-5p在不同临床/病理特征中表达水平比较 [例(%)]

2.4 QPRT、miR-26b-5p表达水平与乳腺癌患者术后复发转移的关系 QPRT高表达组乳腺癌患者术后复发转移率为65.38%(34/52)，明显高于QPRT低表达组的29.73%(11/37)(χ2=13.260，P=0.000)；miR-26b-5p低表达组患者术后复发转移率为63.79%(37/58)，明显高于miR-26b-5p高表达组的25.81%(8/31)(χ2=12.550，P=0.000)，见图3。

图3 QPRT、miR-26b-5p表达水平与乳腺癌患者术后复发转移的关系

2.5 影响乳腺癌患者术后复发转移的COX多因素分析 分化程度低、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴结发生转移、QPRT高表达、miR-26b-5p低表达是影响乳腺癌患者术后复发转移的危险因素(P<0.05)，见表3。

表3 影响乳腺癌患者术后复发转移的COX多因素分析

3 讨 论

乳腺癌是女性最常见的癌症，并逐渐成为影响女性健康的一个重要因素。近年来，全球乳腺癌的发病率和病死率持续上升，2019年美国约有26.8万例乳腺癌新增病例和4.2万死亡病例，其发病率和病死率分别排名第一、二位，占所有新发癌症患者的30%和癌症相关死亡人数的15%，中国和印度等发展中国家的乳腺癌发病率也呈逐年增长趋势[6-9]，因此，早期诊断、及时治疗对改善乳腺癌患者预后具有重要意义。

乳腺癌是一种高度异质性疾病，具有明显的分子特征和基因表达特征[10-11]。随着临床治疗的不断优化，乳腺癌的病死率明显下降，但其远处转移和复发在临床上仍是一个巨大的挑战。Xu等[12]利用4个基因表达数据集(GEO)和癌症基因组图谱(TCGA)对乳腺癌和正常组织的差异表达基因(DEGs)进行分析，结果发现547个DEGs(302个上调，245个下调)，最终确定了7个重要的预后候选基因，QPRT为其中之一。QPRT是一种新生烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)合成途径中的关键酶，以往研究发现QPRT与Wilms肿瘤基因1(WT1)关系密切，是白血病及其他恶性肿瘤的致癌基因[13-14]。QPRT在乳腺癌中的作用越来越受到重视。本结果显示，QPRT在乳腺癌组织中的阳性表达率明显高于正常乳腺组织，表明QPRT在乳腺癌中可能发挥癌基因作用。乳腺癌组织中QPRT表达水平在不同TNM分期、肿瘤分化程度、淋巴结有无转移中比较差异有统计学意义，表明QPRT可能参与乳腺癌的增殖分化、转移侵袭过程。有研究发现，与正常乳腺组织相比，QPRT在乳腺癌组织中过表达，且与患者进展不良有关；体外实验发现，唐氏综合征细胞黏附分子反义RNA1(DSCAM-AS1)通过竞争性结合miR-150-5p和miR-2467-3p增加QPRT表达，可促进乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭，且抑制细胞凋亡[15]。提示QPRT可能与其靶基因结合而表达上调，参与乳腺癌的发生、发展进程。本研究还发现，QPRT高表达患者术后复发转移率明显高于QPRT低表达患者，且QPRT高表达是影响乳腺癌患者术后复发转移的危险因素，表明QPRT高表达与患者预后不良有关，但具体作用机制尚不明了。

miRNA是一类进化高度保守的单链RNA，结合于靶基因的3’-非翻译区，通过阻止翻译或直接降解mRNA来抑制基因表达[16-18]。本研究结果显示，miR-26b-5p在乳腺癌组织中阳性表达率显著低于癌旁正常乳腺组织，并且其表达水平与患者TNM分期、肿瘤分化程度、淋巴结转移及复发转移有关，miR-26b-5p低表达是影响乳腺癌患者术后复发转移的危险因素，表明miR-26b-5p可能参与乳腺癌患者肿瘤细胞分化、侵袭及转移等病理过程。田连芳等[19]研究发现，miR-26b-3p在乳腺癌细胞系MDA-MB-453中表达最低，细胞实验证实miR-26b-3p可抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，通过与其下游靶基因E盒锌指结合蛋白1(ZEB1)结合参与肿瘤的发展过程。另有研究认为[20]，miR-26b作为miR-26家族一员，其在炎性乳腺癌中的表达水平低于非炎性局部晚期乳腺癌，且均低于正常乳腺组织，这种表达下降可能与炎性表型、三阴性状态及治疗后肿瘤残留有关；进一步研究发现，敲除miR-26b可靶向上调Zeste基因增强子同源物2(EZH2)蛋白表达，可能作为炎性乳腺癌和非炎性局部晚期乳腺癌的潜在治疗靶点。本研究Spearman分析显示，乳腺癌组织中QPRT和miR-26b-5p表达水平呈负相关，推测低表达的miR-26b-5p可能靶向上调QPRT表达参与乳腺癌的发生发展，具体作用机制有待进一步细胞实验证实。

综上所述，乳腺癌组织中QPRT表达上调，miR-26b-5p表达下调，二者可能存在靶向关系；其水平差异性表达与患者不良预后有关，可能作为治疗乳腺癌的潜在靶点，具体机制值得进一步研究。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

袁南贵：设计研究方案，实施研究过程，论文撰写；罗雪平：提出研究思路，分析试验数据，论文审核；胡玉萍：实施研究过程，资料搜集整理，论文修改；姚斌：进行统计学分析；黄伟玲：课题设计，论文撰写