酶菌混合处理荞麦秸秆和苜蓿干草对滩羊生长性能、屠宰性能、瘤胃细菌多样性和碳水化合物活性酶类的影响

2021-05-20姜碧薇周玉香

动物营养学报 2021年4期

姜碧薇王甜周玉香* 李斐

(1.宁夏大学农学院，银川 2750021；2.宁夏职业技术学院，银川 2750021)

纤维素酶是由葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和β-葡聚糖苷酶组成的，能够将纤维素降解为葡萄糖的一类酶的总称[1]。饲粮中添加纤维素酶能够有效破解植物细胞壁，提高秸秆的降解率和营养成分含量[2-3]，从而提高反刍动物的生长性能和屠宰性能[4-5]。益生菌是一种对宿主有益的活性微生物，适宜的添加量不仅能够抑制宿主肠道的病原微生物增殖，还可以维持胃肠道的菌群平衡，提高动物的生产性能[6]。复合益生菌剂适应瘤胃的复杂性，能够弥补单一菌剂的局限性，因此更适合于反刍动物使用。目前，复合益生菌发酵粗饲料的处理方法是秸秆饲用化与开发利用研究热点。研究显示酿酒酵母+枯草芽孢杆菌+乳酸菌组合具有良好的协同促进作用[7]。

荞麦秸秆属蓼科双子叶植物[8]，是宁夏南部及中部干旱区常见的作物秸秆，具有较高营养价值，可应用于反刍动物养殖[9]。苜蓿是牧草之王，不仅蛋白质含量高，且品质优。对粗饲料进行加工处理是提高其饲用品质的有效方法。本试验在课题组成员王萌[10]筛选出组合效应值较高的荞麦秸秆和苜蓿干草适宜比例(20∶80)的基础上，采用纤维素酶和复合益生菌(由乳酸菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌等组成)混合处理宁夏地区常见的2种粗饲料荞麦秸秆和苜蓿干草，在饲粮精粗比为30∶70的条件下，研究酶菌混合处理荞麦秸秆和苜蓿干草对滩羊生长性能、屠宰性能、肉品质、瘤胃细菌多样性和碳水化合物活性酶类(carbohydrate-active enzymes，CAZy)的影响，以期为秸秆饲料资源的开发利用及其在滩羊生产实践中的科学应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 酶菌混合处理荞麦秸秆与苜蓿干草的制备

取适量荞麦秸秆和苜蓿干草，用粉碎机粉碎至3～5 cm备用。按照配制比例准确称取纤维素酶(活性≥10 000 U/g；添加量为0.1%)、复合益生菌[主要成分为酵母菌(活菌数≥1.0×108CFU/g)、乳酸菌(活菌数≥1.0×107CFU/g)和枯草芽孢杆菌(活菌数≥5.0×107CFU/g)，添加量为2 kg/t]和麦麸(按照待处理粗饲料的1%称取)后，加入适量的水，充分搅拌，混合均匀后采取喷淋的方式，边喷洒边搅拌，使水溶液与待处理粗饲料充分混合并将含水量调至70%左右，最后利用青贮裹包机直接打捆包膜密封保存30 d。荞麦秸秆和苜蓿干草处理前后分别测定其营养物质含量，其中干物质含量参照GB/T 6435—2006《饲料水分的测定方法》测定，粗蛋白质(CP)含量参照GB/T 6435—2006《饲料中粗蛋白测定方法》测定，中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)含量参照Van Soest等[11]的方法进行测定，粗灰分含量参照GB/T 6435—2006《饲料中粗灰分的测定方法》测定，钙(Ca)含量采用高锰酸钾法测定，磷(P)含量采用钼黄比色法测定。处理前后荞麦秸秆和苜蓿干草营养成分含量见表1。

表1 处理前后荞麦秸秆和苜蓿干草营养成分含量(干物质基础)

1.2 饲养试验

饲养试验于2019年7月至2019年9月在宁夏农垦贺兰山牛羊产业集团有限公司进行。选择体重[(31.99±2.10) kg]相近、健康状况良好、断奶后的3月龄滩羊(公羊)20只，随机分为2组(对照组和试验组)，每组10只。对照组饲粮以未经处理的荞麦秸秆和苜蓿干草(二者比例为20∶80)作为粗饲料，试验组饲粮以酶菌混合处理荞麦秸秆和苜蓿干草(二者比例为20∶80)作为粗饲料，2组饲粮精料相同，精粗比均为30∶70。试验饲粮参照农业行业标准NY/T 816—2004《肉羊饲养标准》和生产实践配制，其组成及营养水平见表2。

表2 试验饲粮组成及营养水平(干物质基础)

参试羊在试验前进行驱虫和防疫，定期对圈舍进行消毒与清扫。预试期15 d，正试期60 d，每日分早晚(06：30和18：00)等量饲喂，自由饮水。

1.3 样品采集与指标测定

1.3.1 生长性能的测定

从正试期开始，每日准确记录羊只的给料量与剩料量，计算干物质采食量。在试验开始当天早晨空腹称取参试羊的体重作为初始体重，在试验结束当天称取参试羊的体重作为结束体重。计算每只羊60 d的总增重、平均日增重(ADG)和料重比(F/G)。

1.3.2 屠宰性能指标的测定

饲养试验结束后，每组选择5只体重接近平均体重的羊只禁食24 h、禁水2 h后屠宰，进行屠宰性能相关指标测定。

宰前活重：屠宰前禁食24 h、禁水2 h后所称取的重量。

胴体重：屠宰放血后，剥去毛皮，去头、蹄、内脏后整个躯体(保留肾脏及其周围脂肪)静置30 min后称取的重量。

净肉重和骨重：胴体在温热情况下去除肾脏及其周围脂肪，骨头被精细剔除后余下的重量为净肉重，剔除骨头的重量为骨重。

胴体脂肪重：在温热情况下将胴体的脂肪与肌肉精细剔除后，称取脂肪的重量。

尾部脂肪重：在温热情况下将脂肪精细剔除后，称取尾部脂肪的重量。

屠宰率：胴体重占宰前活重的百分比。

骨肉比：胴体骨重与净肉重的比率。

眼肌面积：测量胴体第12～13肋骨脊柱上方背最长肌的横切面积。

GR值：用游标卡尺准确量取胴体第12～13助骨间，距背脊中线11 cm处的组织厚度。

1.3.3 肉品质及营养成分含量的测定

屠宰后取肩、股、背部肉样，用嫩度测定仪(RH-N50，广州润湖仪器有限公司)、系水力测定仪(RH-1000，广州润湖仪器有限公司)进行肉品质指标测定，具体操作参考侯鹏霞[12]的测定方法。羊肉营养成分含量参考AOAC(1990)[13]中的方法测定。

1.3.4 瘤胃液的采集、DNA提取及建库测序

于屠宰当天清晨空腹采集瘤胃液，每组选择3只参试羊，采用负压采集器，经导管通过口腔食道，深入到瘤胃中部，采集瘤胃液约100 mL，每个瘤胃液样品通过4层薄纱布过滤，液氮冷冻保存。将瘤胃液样品送至广州基迪奥生物科技有限公司进行V3+V4区扩增并进行Illumina HiSeq平台基因组测序。

1.4 数据统计与分析

生长性能、屠宰性能、肉品质、羊肉营养成分含量和瘤胃细菌多样性数据用Excel 2007记录并作简单处理后，采用SAS 8.2软件进行方差分析，利用LSD法进行多重比较，以P<0.05作为差异显著的判断标准，P<0.01作为差异极显著的判断标准。宏基因组数据基于dbCAN数据库采用谱隐马尔可夫模型，分析CAZy基因相似性。基于原始reads数，采用DESeq2 (V1.10.1)进行差异分析，绘制CAZy基因丰度差异散点图。

2 结果与分析

2.1 酶菌混合处理荞麦秸秆和苜蓿干草对滩羊生长性能的影响

由表3可知，试验组总增重和平均日增重极显著高于对照组(P<0.01)，分别比对照组提高了40.33%和40.32%；试验组料重比极显著低于对照组(P<0.01)，比对照组降低了28.43%；其余各项生长性能指标试验组与对照组之间差异不显著(P>0.05)。上述结果说明用酶菌混合处理的荞麦秸秆和苜蓿干草饲喂滩羊，提高了滩羊的增重。

表3 酶菌混合处理荞麦秸秆和苜蓿干草对滩羊生长性能的影响

2.2 酶菌混合处理荞麦秸秆和苜蓿干草对滩羊屠宰性能的影响

由表4可知，试验组与对照组之间各项屠宰性能指标均无显著差异(P>0.05)，但试验组的胴体重、屠宰率和净肉重分别比对照组提高了2.56%、2.23%和3.22%。上述结果说明用酶菌混合处理的荞麦秸秆和苜蓿干草饲喂滩羊，有提高滩羊胴体重、屠宰率和净肉重的趋势。

表4 酶菌混合处理荞麦秸秆和苜蓿干草对滩羊屠宰性能的影响

2.3 酶菌混合处理荞麦秸秆和苜蓿干草对滩羊肉品质和营养成分含量的影响

由表5可知，试验组与对照组羊肉各部位pH介于6.67～6.91，试验组失水率、剪切力和滴水损失分别比对照组降低了7.25%、1.79%和15.13%，熟肉率以及肉色红度(a*)、黄度(b*)和亮度(L*)值分别比对照组提高了5.64%、3.63%、5.12%和0.71%，但试验组与对照组相比各项肉品质指标均无显著差异(P>0.05)。上述结果说明用酶菌混合处理的荞麦秸秆和苜蓿干草饲喂滩羊，具有改善滩羊肉色和肉品质的趋势。

表5 酶菌混合处理荞麦秸秆和苜蓿干草对滩羊肉品质的影响

由表6可知，试验组与对照组羊肉各营养成分含量均无显著差异(P>0.05)，但试验组粗脂肪含量比对照组降低了9.25%，粗蛋白质含量比对照组提高了4.31%。上述结果说明用酶菌混合处理的荞麦秸秆和苜蓿干草饲喂滩羊，有降低滩羊肉脂肪含量、提高滩羊肉蛋白质含量的趋势。

表6 酶菌混合处理荞麦秸秆和苜蓿干草对滩羊肉营养成分含量的影响

2.4 酶菌混合处理荞麦秸秆和苜蓿干草对滩羊瘤胃细菌多样性的影响

2.4.1 对滩羊瘤胃细菌操作分类单元(OTU)数目的影响

对照组的3个平行样本共获得reads 114 683 920个，试验组3个平行样本共获得reads 138 106 628个。由表7可知，对照组与试验组覆盖度均大于0.98，能够准确反映滩羊瘤胃内的细菌组成情况；试验组OTU数目比对照组降低了3.76%，但差异不显著(P>0.05)。上述结果说明用酶菌混合处理的荞麦秸秆和苜蓿干草饲喂滩羊，对滩羊瘤胃细菌OTU数目的影响不大。

表7 瘤胃细菌OTU数目

2.4.2 对滩羊瘤胃细菌Alpha多样性的影响

由表8可知，试验组的Chao指数和ACE指数极显著低于对照组(P<0.01)，Shannon指数和Simpson指数也低于对照组，但差异不显著(P>0.05)。上述结果说明用酶菌混合处理的荞麦秸秆和苜蓿干草饲喂滩羊，降低了其瘤胃细菌的Chao指数和ACE指数，对瘤胃细菌的Alpha多样性有一定影响。

表8 16S rDNA检测Alpha多样性

2.4.3 对滩羊瘤胃细菌Beta多样性的影响

图1为所测样本瘤胃微生物群落的主坐标分析(PCoA)。由图1可知，主坐标成分1(PCo1)和主坐标成分2(PCo2)对样本间变异的贡献度分别为70.44%和14.45%，能够充分解释样本间的变异；PCoA显示，同组内样本距离较近，说明同组内物种多样性差异较小，对照组与试验组之间样本距离较远，说明对照组与试验组之间瘤胃细菌多样性有所差异。

图1 瘤胃细菌OTU数目主坐标分析

2.4.4 对滩羊瘤胃细菌优势群及差异物种的影响

由表9可知，在门水平上，对照组与试验组的优势菌门均为变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门和Kiritimatiellaeota，其总量占总菌门的95%以上。其中，试验组厚壁菌门的丰度显著高于对照组(P<0.05)，拟杆菌门和Kiritimatiellaeota的丰度极显著低于对照组(P<0.01)，变形菌门的丰度与对照组差异不显著(P>0.05)。上述结果说明用酶菌混合处理的荞麦秸秆和苜蓿干草饲喂滩羊，降低了其瘤胃细菌内拟杆菌门和Kiritimatiellaeota的数量，提高了厚壁菌门的数量。

表9 全样本优势菌门丰度

由表10可知，在属水平上，对照组与试验组的优势菌属为丛毛单胞菌属(Comamonas)、普雷沃氏菌属1(Prevotella_1)、不动杆菌属(Acinetobacter)、赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus)、库特氏菌属(Kurthia)、克里斯滕森菌科R-7群(Christensenellaceae_R-7_group)、理研菌科RC9肠道群(Rikenellaceae_RC9_gut_group)、鲁梅尔芽孢杆菌属(Solibacillus)和瘤胃球菌科NK4A214群(Ruminococcaceae_NK4A214_group)。其中，试验组Prevotella_1、Kurthia、Christensenellaceae_R-7_group和Solibacillus的丰度极显著高于对照组(P<0.01)，Comamonas、Acinetobacter、Lysinibacillus、Rikenellaceae_RC9_gut_group和Ruminococcaceae_NK4A214_group的丰度与对照组差异不显著(P>0.05)。上述结果说明用酶菌混合处理的荞麦秸秆和苜蓿干草饲喂滩羊，提高了其瘤胃内Prevotella_1、Kurthia、Christensenellaceae_R-7_group和Solibacillus的数量。

表10 全样本优势菌属丰度

2.5 酶菌混合处理荞麦秸秆和苜蓿干草对滩羊瘤胃内CAZy的影响

本试验中，对照组3个平行样本共获得基因5 569 976个，试验组3个平行样共获得基因5 921 304个。与CAZy数据库对比可得各样品CAZy注释图(图2)。由图2可知，在A层级中，试验组与对照组CAZy的基因数量由高到低排序均为糖苷水解酶(GH)>糖基转移酶(GT)>碳水化合物结合模块(CBM)>糖类酯解酶(CE)>多糖裂解酶(PL)>辅助氧化还原酶(AA)。该结果表明，用酶菌混合处理荞麦秸秆和苜蓿干草作为粗饲料饲喂滩羊，其瘤胃内降解植物纤维素的CAZy主要是GH、GT和CBM。在B层级中，丰度排名前5的见表11。由表11可知，试验组与对照组CAZy较高丰度家族基因reads数目排名一致，且均无显著差异(P>0.05)。基于DESeq2差异分析，绘制基因散点图(图3)，图中红色表示丰度显著上调的基因(P<0.05)，绿色表示丰度显著下调的基因(P<0.05)，灰色表示丰度无显著变化基因(P>0.05)。由图3可知，用酶菌混合处理后的荞麦秸秆和苜蓿干草饲喂滩羊，可引起滩羊瘤胃部分基因丰度上调或下调。由表12可知，与对照组相比，试验组丰度上调的有CBM83、CBM60等12个基因(P<0.05)，丰度下调的有AA1、GH126和AA12共3个基因(P<0.05)。

表12 对照组与试验组CAZy丰度DEseq2差异分析表

AA：辅助氧化还原酶 auxiliary oxidoreductase；GH：糖苷水解酶 glycoside hydrolase；GT：糖基转移酶glycosyltransferase；PL：多糖裂解酶 polysaceharide lyase；CE：糖类酯解酶 carbohydrate esterase；CBM：碳水化合物结合模块carbohydrate binding module。

表11 CAZy较高丰度家族基因reads数目(B层级)

图3 对照组与试验组CAZy丰度的DESeq2差异分析图

3 讨论

3.1 酶菌混合处理荞麦秸秆和苜蓿干草对滩羊生长性能的影响

用纤维素酶处理粗饲料后饲喂反刍动物，能够有效地提高反刍动物的生长性能。张芹等[14]研究发现，外源酶促进了反刍动物对饲料的消化和利用，提高了日增重和产奶量，这与本试验结果一致。益生菌发酵饲料对于羔羊补饲和成年羊育肥的作用效果十分显著[15]。有研究学者给羔羊饲喂布氏乳杆菌11A44发酵的野豌豆饲料，结果表明，羔羊的日增重为184 g，显著高于对照组，生张性能得到了明显的改善[16]，这与本试验结果一致。本试验用酶菌混合处理的荞麦秸秆和苜蓿干草饲喂滩羊，显著提高了滩羊的总增重、平均日增重，降低了料重比，说明该处理方法促进了滩羊对饲粮中营养物质的吸收，提高了滩羊的生长性能。

3.2 酶菌混合处理荞麦秸秆和苜蓿干草对滩羊屠宰性能的影响

屠宰性能可以反映出动物的生长情况。屠宰率、净肉重和胴体重等指标与动物产肉力的好坏直接相关，并影响经济效益。本试验中，试验组与对照组的各项屠宰性能指标差异均不显著，但试验组胴体重、屠宰率和净肉重与对照组相比均有上升趋势，这与Kim等[17]的试验报道相似。Zobell等[18]报道，纤维素酶制剂对育肥牛的眼肌面积无显著影响，这与本试验结果一致。

3.3 酶菌混合处理荞麦秸秆和苜蓿干草对滩羊肉品质和营养成分含量的影响

羊肉pH决定了肉品质的优劣。本试验中对照组与试验组羊肉pH介于6.67～6.91，均属于正常范围。熟肉率与烹煮损失有密切关系，数值越高则烹煮损失越小。试验组的熟肉率比对照组有所增加，说明用酶菌混合处理荞麦秸秆和苜蓿干草饲喂滩羊，有改善滩羊肉品质的作用。有报道称，芽孢杆菌可以提高育肥猪的胴体品质[19]，本试验结果与此一致。试验组的肉色与对照组相比有提高的趋势，说明酶菌混合处理荞麦秸秆和苜蓿干草能够改善滩羊的肉色。

肌肉的常规营养成分含量可以直观反映肉品质。有研究报道，滩羊肉的水分含量为77%左右[20]，这与本试验结果一致。肌肉中的脂肪可以有效改善滩羊肉的风味并满足人们对肉质口感的要求，但羊肉脂肪含量过高则会使人体摄入过多的胆固醇，提高心血管的发病概率。本试验中试验组与对照组羊肉的粗脂肪含量均在正常范围内，但试验组粗脂肪含量低于对照组，说明用酶菌混合处理的荞麦秸秆和苜蓿干草饲喂滩羊，有降低滩羊肉粗脂肪含量的趋势，有助于减少人体胆固醇的摄入量。据王思飞[21]报道，7月龄滩羊的羊肉中粗蛋白质含量为16.05%，低于本试验结果，分析原因可能与参试羊年龄有关，本试验选择的羊只为3月龄断奶羔羊，其生长以肌肉生长为主。

3.4 酶菌混合处理荞麦秸秆和苜蓿干草对滩羊瘤胃细菌多样性的影响

16S rDNA高通量测序技术可用作分析不同菌种中序列的多样性和鉴定菌种的类别[22]，是不用分离培养微生物而进行鉴定的一种方法，被广泛利用。Kong等[23]研究了不同粗饲料对奶牛瘤胃细菌多样性及结构的影响，结果发现，厚壁菌门和拟杆菌门占整个细菌门水平的比例较大，这与本试验结果一致。在门水平上，厚壁菌门是反刍动物瘤胃纤维降解菌中十分重要的菌群；在属水平上，普雷沃氏菌属是瘤胃数量最多的一类细菌[24]，能够促进瘤胃纤维物质的降解，是瘤胃中的优势菌群[25]，这与本试验结果一致。试验组厚壁菌门的丰度显著高于对照组，Prevotella_1的丰度显著高于对照组，说明用酶菌混合处理的荞麦秸秆和苜蓿干草饲喂滩羊，提高了滩羊瘤胃内部分纤维降解菌的数量，促进了滩羊瘤胃对粗饲料的消化和吸收；此外，试验组的Chao指数和ACE指数极显著低于对照组，用酶菌混合处理的荞麦秸秆和苜蓿干草饲喂滩羊，对滩羊瘤胃细菌多样性也产生了一定影响。

3.5 酶菌混合处理荞麦秸秆和苜蓿干草对滩羊瘤胃CAZy的影响

CAZy数据库是专门研究CAZy的数据库。反刍动物可通过瘤胃内的部分微生物分泌的降解酶对其进行降解并为机体供能。因此，许多学者通过研究瘤胃液的木质纤维素降解机制挖掘未知的CAZy[26]。CAZy共分为6大功能类，其中GH、CE和PL能够协同作用降解木质纤维素物质[27-28]。本试验结果表明，对照组与试验组GH家族基因丰度均最高，其次是GT和CBM，PL和CE丰度较低，这与胡丹丹[29]的研究结果一致。Lynd等[30]研究表明，CBM是纤维素酶的重要组成部分，同时具有催化作用，能促进酶与纤维物质结合，从而促进纤维物质的降解。目前CBM包含84个家族成员。有研究通过CAZy预测功能表明，CBM6是纤维素降解酶，能够促进纤维素的降解[31]，本试验中，CBM6基因丰度较高，说明该处理方式提高了滩羊瘤胃内部分纤维降解酶的活性，提示滩羊对纤维素降解作用较好。CBM50具有与细胞壁降解的相关基因[32]，且从CAZy数据库中发现与拟杆菌门有关。本试验中，试验组拟杆菌门的丰度显著低于对照组，但CBM50基因reads数目与对照组无显著差异，分析原因可能是滩羊瘤胃内其他细菌数量也与CBM50基因有关。试验组部分基因的丰度与对照组相比有显著上调或下调情况，但这些基因都不是丰度较高的基因，这可能与滩羊饲喂酶菌混合处理的荞麦秸秆和苜蓿干草有关，但具体作用机理有待进一步研究。