降解园林废弃物专用固体复合菌的构建及其堆肥效应研究

付冰妍, 孙向阳, 余克非, 李素艳

北京林业大学林学院, 北京 100083

近年来，全国各地城市绿化面积不断增加，园林废弃物已成为城市固体废弃物的重要组成部分[1-3]. 在园林废弃物的处理方法中，生物堆肥法因能耗低、降解率高、对环境友好等优点而被广泛应用[4-5]. 相较于单一菌剂而言，复合菌剂产酶具有多样性，在各种酶的相互协同作用下有利于加快园林废弃物的降解[6]，此外，复合菌剂中不同菌株的环境适应性有所差异，致使其能够更好地适应堆肥过程中极端的环境变化，发挥更大的作用. 但过去关于复合菌剂的研究主要集中于液体菌剂，液体菌剂存在研制需严格无菌操作条件、产品不便于存储运输等缺陷[7]，因此，尝试制备固体菌剂替代液体菌剂. 固体菌剂不仅能够弥补液体菌剂在研制和存储方面的不足，还具有成本较低、工艺相对简单等优点[8-9]，因而选用固体菌剂作为微生物制剂用于园林废弃物堆肥具有明显的优越性. 但目前国内外关于固体复合菌剂制备的研究尚不充分[10-12]，而固体复合菌剂的应用又大多以抑制植物病虫害或促进植物生长等方面的研究为主[13]，鲜见园林废弃物堆肥方面的研究. 鉴于此，该研究利用前期获得的两株可降解木质素和纤维素的固体菌剂——芽孢杆菌(Bacillussp.)B01和B02，在此基础上将其混配成固体复合菌剂，以木质素和纤维素降解率为指标，探究固体复合菌剂的接种浓度和比例最佳值，构建可高效降解园林废弃物的固体复合菌系，并进一步研究其在堆肥过程中的应用效果，旨在为园林废弃物专用固体复合菌剂的制备及其在堆肥过程中的应用提供理论基础.

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1供试菌株

芽孢杆菌B01和B02均分离自腐熟堆肥，笔者所在实验室筛选并保藏，菌落形态见图1.

图1 芽孢杆菌B01和B02的菌落形态

1.1.2培养基

种子液培养基[14]：采用牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏3 g，蛋白胨5 g，氯化钠5 g，蒸馏水 1 000 mL，琼脂20 g).

B01固态发酵培养基：35%麦麸、45%米糠、6%乳糖、6%黄豆粉、8%硅藻土.

B02固态发酵培养基：25%麦麸、50%米糠、7%乳糖、7%黄豆粉、11%硅藻土.

1.1.3堆肥原材料

堆肥原料取自北京植物园香山堆肥厂的枯枝落叶，并测定其基本理化性质. 堆肥原材料pH为5.87，电导率(EC)为0.79 mS/cm，腐殖质含量为32.97 g/kg，种子发芽指数为53.69%.

1.2 试验方法

1.2.1单一菌株固体菌剂的制备

向500 mL锥形瓶中加入50 g固态发酵培养基，在121 ℃条件下灭菌20 min. 将B01和B02按照15%接种量分别接入其相应的固态发酵培养基中，置于恒温(37 ℃)培养箱中培养48 h，烘箱烘干，即制得固体菌剂B01、B02. 此时，B01和B02固态发酵物活菌体数分别可达到2.6×1010和4.5×109CFU/g.

1.2.2单一菌株液体菌剂的制备

向250 mL锥形瓶中装入50 mL种子液培养基，将B01和B02单菌落分别接入其中，在恒温振荡器 (37 ℃，200 r/min)中分别培养60和49 h，即制得液体菌剂B01、B02. 此时B01和B02液态发酵活菌体数分别可达1.0×1010和1.0×109CFU/mL.

1.2.3筛选最佳固体复合菌剂正交试验

按照固体复合菌剂接种量1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%及复合比例(B01∶B02)10∶0、7.5∶2.5、5∶5、2.5∶7.5、0∶10接入园林废弃物中进行好氧堆肥试验，共计25组处理，每组处理均做3个平行. 在每个锥形瓶中加入80 g未灭菌的园林废弃物，然后将各处理组依次加入园林废弃物中，振荡摇匀后用自来水调节含水率为60%～65%，置于25～50 ℃的恒温培养箱中培养. 发酵周期为28 d，于第28天取样，测定样品中木质素、纤维素含量，计算每组处理的木质素、纤维素降解率，并以降解率为指标，选出最佳固体复合菌剂.

1.2.4堆肥验证试验

试验共设置3个处理，包括CK(不添加菌剂)、LB012(接种液体复合菌剂)、SB012(接种固体复合菌剂)，其中，SB012处理组按照最佳配比添加固体菌剂，同时设置SB012和LB012两组处理添加菌剂的活菌数相同，每组处理均做3个平行. 于恒温培养箱中进行好氧堆肥试验，堆肥试验周期为28 d，模拟堆肥过程中的温度变化，1～5 d内将温度从25 ℃升至50 ℃，5～8 d内温度始终保持在50 ℃，18～28 d内将温度从50 ℃降至25 ℃. 此外，该培养箱能够自动通气，每2 d翻堆(用玻璃棒上下搅拌)一次，每4 d取样一次，样品分成2份，其中一份风干备用，另一份存放于4 ℃冰箱中待用.

1.3 指标测定及方法

pH、EC测定以水肥质量比10∶1浸提，采用pH计和电导率仪测定[15]. 测定种子发芽指数(GI)时，吸取5 mL浸提液(水肥质量比10∶1浸提)，加到铺有滤纸的培养皿中，每个培养皿放置20粒小白菜种子，在25 ℃恒温培养箱中培养4 d，计算GI值. 腐殖质含量采用焦磷酸钠浸提-K2Cr2O7容量法测定；胡敏酸、富里酸含量采用焦磷酸钠提取-重铬酸钾法测定；木质素含量采用浓硫酸水解法测定；纤维素含量采用硝酸乙醇法测定[16-17].

2 结果与讨论

2.1 筛选最佳固体复合菌剂正交试验结果

木质纤维素是园林废弃物的主要成分，其降解率是评价堆肥腐熟程度的重要指标，因此该试验选用L25(5)6正交表，探究不同复合比例和复合菌剂接种浓度对木质素、纤维素降解率的影响，从而筛选出最佳固体复合菌剂，结果见表1.

表1 正交试验结果

表2 木质素和纤维素降解率正交试验结果极差分析

2.2 堆肥试验结果

2.2.1堆肥腐熟过程中的pH和EC变化分析

堆肥过程中pH的变化情况如图2所示. 堆肥原材料的pH为5.87，而3组处理堆肥产品的pH在8.10～8.40之间，可以看出在堆肥过程中pH总体呈上升趋势，这与田赟等[19]的研究结果一致. 各处理的pH变化趋势基本一致，均呈先上升后下降的趋势. 这是因为在堆肥初期微生物大量分解有机质产生NH3，致使pH上升；此后硝化作用增强，同时氨化作用减弱，氨气挥发，致使pH下降[20]. 堆肥结束时，各堆体的pH从大到小依次为LB012、CK、SB012，只有SB012处理组的pH同时达到了GB 31755—2015《绿化植物废弃物处置和应用技术规程》和LY/T 2700—2016《花木栽培基质》的标准限值.

表3 木质素和纤维素降解率正交试验结果方差分析

图2 堆肥过程中pH的变化情况

堆肥过程中EC的变化情况如图3所示. 由图3可见，各处理组的EC变化趋势大致相同，均呈现出先上升、后降低、再上升、最后缓慢下降的趋势. 这是因为初期堆肥原料在微生物的分解下，产生大量小分子物质致使EC上升，随后由于NH3的挥发以及硝化细菌矿化产生NO3-，致使EC呈现出先下降后上升的趋势，最后随着堆肥腐殖化进程和芳构化程度的提高，各处理组的EC开始缓慢下降. 堆肥结束时，CK、LB012、SB012三组处理的EC分别为0.75、0.74、0.77 mS/cm，均达到了Garcia等[21]提出的堆肥电导率的标准(<4 mS/cm)，而CK和LB012处理组EC偏低主要是因为堆体内物质未被完全分解.

图3 堆肥过程中EC的变化情况

2.2.2堆肥过程中腐殖质含量及其组成的变化特征

由图4可见，堆肥过程中，各处理组的腐殖质含量均呈先下降后上升的趋势. 这是因为堆肥初期腐殖质中分子量小、结构简单的物质被微生物大量降解，致使其分解速率大于合成速率，腐殖质总含量呈下降趋势. 随着堆肥的进行，易降解的有机物减少，微生物开始利用难降解的木质素、纤维素作为碳源，同时，也逐渐生成了稳定性高、结构复杂的腐殖质，致使腐殖质总含量增加. 堆肥结束时，LB012、SB012两个处理组的腐殖质含量分别为34.80、36.99 g/kg，与未堆肥前的物料相比，分别提高了5.55%、12.19%；而CK处理组的腐殖质含量为31.98 g/kg，较未堆肥前的物料降低了3%. 与LB012和CK处理相比，SB012处理组可使腐殖质含量提高6.29%和15.67%，说明添加固体复合菌剂SB012提高了堆肥产品中腐殖质含量. 这主要是因为腐殖质的形成与微生物及其分泌的酶关系十分密切，而固态发酵产酶量一般比液态发酵高出2～3倍[22]，添加固体复合菌剂SB012更有利于将木质纤维素类物质转化成腐殖质前体物质，促进腐殖质合成.

图4 堆肥过程中腐殖质、胡敏酸、富里酸含量的变化

胡敏酸和富里酸是腐殖质的重要组分，在堆肥进程中二者同时存在自身的分解与合成过程，其含量的变化会影响腐殖质的质量，各处理组胡敏酸和富里酸含量的变化情况见图4. 可以看出，堆肥原材料中富里酸含量高于胡敏酸含量，随着堆肥过程的推进，胡敏酸含量呈先下降后上升、总体表现为上升的趋势，而富里酸含量呈先上升后下降、整体呈下降的趋势，这与XIAO等[23]的研究结果一致. 堆肥结束时，LB012、SB012、CK三组处理的胡敏酸含量较初期的增幅分别达34.87%、55.60%、15.40%，富里酸含量较初期的降幅分别达18.92%、24.04%、18.42%. 从胡敏酸含量的增加趋势和富里酸含量的降低趋势可以看出，各处理对二者形成的影响有明显差异，SB012处理组能够更好地促进结构简单的富里酸向结构复杂的胡敏酸转化，从而提高腐殖质的质量.

腐殖化系数(HI)为胡敏酸与富里酸含量的比值，是评价堆肥腐殖化水平的重要标准[24]. 由图5可知，各处理的HI总体均表现为上升趋势，有别于其他两个处理组的是，在第12天以后SB012处理组的HI出现了大幅增加阶段，这说明与不添加菌剂(CK)和添加液体复合菌LB012的处理相比，添加固体复合菌剂SB012能够促进胡敏酸的合成，提高堆肥腐殖化系数. 堆肥结束后，LB012、SB012、CK处理组的HI分别为1.39、1.71、1.18，与LB012和CK处理组相比，SB012处理组使HI提高了23.02%和44.92%. 而郑卫聪等[25]研究表明，在为期30 d的堆肥过程结束时，HI仅达到1.20. 这说明添加固体复合菌剂SB012能够提升堆肥腐殖化水平，加速堆肥腐熟进程.

图6 堆肥过程中木质素和纤维素降解率的变化情况

2.2.3不同处理对堆肥木质素和纤维素降解的影响

如图6所示，3组处理的木质素和纤维素降解率的变化趋势相近，但SB012和LB012处理组明显优于CK处理组，在堆肥结束时，与添加液体复合菌LB012和不添加菌剂(CK)相比，添加固体复合菌剂SB012可使木质素降解率分别提高7.79%和49.74%，纤维素降解率分别提高5.30%和46.82%，可以看出添加固体复合菌剂SB012更有利于促进木质素和纤维素的降解. 这可能是因为，B01和B02是从腐熟堆肥中筛出的具有降解木质素、纤维素能力的功能菌，使得SB012和LB012两组处理的木质素和纤维素降解率明显高于CK处理组，并且固体菌剂SB012相较于液体菌剂LB012而言更易与堆肥材料混匀[26]，使微生物均匀地生长于堆体之间，从而能够更好地发挥其降解作用. 此外，由于SB012处理组可更高效地促进木质纤维素降解，加速堆肥腐殖化进程，致使在整个堆肥周期中SB012处理组的腐殖质含量始终高于LB012处理组，而腐殖质具有增强细菌的传输分散作用[27]，使B01和B02能够更好地在堆肥颗粒介质中扩散，更进一步促进木质素纤维素降解，形成良性循环，加快堆腐速率.

2.2.4堆肥过程中种子发芽指数(GI)的变化情况

研究表明，GI是较可靠地反映堆肥腐熟度的指标，GI大于80%的堆肥产品被认为完全腐熟[28-30]. 如图7所示，各处理组的GI均呈上升趋势，除CK处理组外，其他两个处理组的GI均在80%以上，其中SB012处理组GI的增速较快，在第16天就达到了83.54%，相对LB012处理组提前了4 d. 在堆肥结束时，与添加液体复合菌LB012和不添加菌剂(CK)相比，固体复合菌剂SB012可使GI分别提高5.34%和30.12%. 这说明添加固体复合菌剂SB012能够有效提高堆肥效率，降低堆肥产品毒性.

图7 堆肥过程中发芽率指数值(GI)的变化

3 结论

a) 在筛选最佳固体复合菌剂过程中，通过正交试验发现，复合比例和复合菌剂接种浓度均对菌剂降解效果有极显著影响，其中复合比例是主控因子，其次是复合菌剂接种浓度. 最终得出最佳固体复合菌剂是复合比例(B01∶B02)为7.5∶2.5，复合菌剂接种浓度为2.5%，在该条件下，木质素和纤维素降解率达到最大值并明显优于其他处理组，此时，木质素降解率可达21.74%，纤维素降解率可达38.28%.

b) 堆肥结束时，与LB012处理组相比，SB012处理组可使腐殖质含量提高6.29%，腐殖化系数(HI)提高23.02%，木质素降解率提高7.79%，纤维素降解率提高5.30%，GI提高5.34%；与CK处理组相比，SB012处理组可使腐殖质含量提高15.67%，腐殖化系数(HI)提高44.92%，木质素降解率提高49.74%，纤维素降解率提高46.82%，GI提高30.12%. 堆肥试验结果表明，向园林废弃物堆肥中添加固体复合菌剂SB012在一定程度上能够促进有机物降解，提高堆肥产品品质.

致谢：在此感谢北京市教育委员会生态修复工程学高精尖学科建设项目的资助.