黑龙江中央站黑嘴松鸡国家级自然保护区不同森林类型土壤微生物功能多样性分析
2021-05-20程智超杨立宾王文浩尹伟平李国富宋福强
程智超, 杨立宾, 隋 心*, 张 童, 王文浩, 尹伟平, 李国富, 宋福强
1.黑龙江大学生命科学学院, 黑龙江省寒地生态修复与资源利用重点实验室, 黑龙江 哈尔滨 150080
2.黑龙江省科学院自然与生态研究所, 黑龙江 哈尔滨 150040
3.黑龙江中央站黑嘴松鸡国家级自然保护区服务中心, 黑龙江 嫩江 161400
在生态系统中,土壤微生物不仅参与养分循环和代谢过程[1],而且直接影响地球生物化学循环[2],在植物凋落物的分解中起着重要作用[3],并通过改善土壤中的微生物含量间接影响植被的生长[4]. 地质条件及植被等多种因素又对土壤微生物活性和多样性特征具有反馈作用[5-6],随着植被组成的变化,土壤微生物生物量、活性、群落结构以及多样性均呈现明显变化[7-10]. 土壤微生物是森林生态系统重要的组成部分,在植被更新和演替过程中的作用尤其明显. 土壤微生物群落和功能的改变会影响地上植物组成和多样性. 因此,研究植被组成变化与土壤微生物结构和功能的变化是目前生态学的研究热点,也是探究生态系统机制的重点研究领域.
森林生态系统是陆地生态系统的重要组成部分,在涵养水源、保育土壤、生态系统碳循环等方面具有重要作用[11]. 森林土壤不但是动植物分解和循环的场所[12],而且还是林木生存的物质基础[13]. 植物对土壤环境的重要影响之一是改变土壤微生物群落特征[14]. 例如,孙雪等[15]对原始红松林退化演替后不同森林类型土壤微生物功能多样性的分析发现,处于不同森林植被演替阶段的土壤微生物碳源利用强度差异显著. 而且,逄好胜等[16]对大兴安岭森林退化后不同植被类型土壤微生物功能多样性的研究发现,3种植被退化类型的土壤微生物利用碳源存在较大差异. 由此可以预见,原始森林发生退化后,不同森林类型阶段土壤微生物功能会发生明显改变. 但是到目前为止,关于大小兴安岭交错区不同森林类型的土壤微生物功能多样性的变化尚不清楚.
黑龙江中央站黑嘴松鸡国家级自然保护区地处大小兴安岭过渡区,其森林类型具有大兴安岭和小兴安岭植被的特征. 但是由于人类活动的影响,以兴安落叶松为建群种的原始林受到了大规模破坏,原始兴安落叶松林面积减少,随之而来的是次生演替以后出现的大量白桦林和蒙古栎林. 森林类型的改变尤其是其建群种的改变会导致生态系统功能发生变化,土壤生态系统受到地上植被组成的影响更为显著,但遗憾的是,目前关于植被变化或者说植被长期演替以后,土壤生态系统功能在森林交错区的研究还很少,对于森林交错区土壤微生物功能的特征还缺乏深入研究. 鉴于此,该研究利用Biolog-Eco微平板技术,对黑龙江中央站黑嘴松鸡国家级自然保护区3种典型的森林类型(兴安落叶松林、白桦林、蒙古栎林)土壤微生物功能多样性的变化规律进行研究,旨在探讨寒温带森林生态系统发生次生演替后土壤微生物群落功能的差异和变化规律,以期为深入了解我国寒温带森林交错区森林生态系统功能和未来发展趋势提供依据和数据基础.
1 材料与方法
1.1 研究区域
试验地点位于黑龙江中央站黑嘴松鸡国家级自然保护区(126°00′E~126°45′E、48°30′N~48°50′N),该保护区位于黑龙江省黑河市西南部,地处小兴安岭西南山麓与松嫩平原的过渡地带,总面积988.6 km2. 属温带大陆性季风气候区,冬季严寒漫长,夏季凉爽短促;年均气温-0.5 ℃,无霜期为121 d,年均降雨量476.33 mm,多年平均相对湿度69.2%. 不同森林类型呈随机性分布,受周边环境影响,处于不同演替阶段的植物群落均有分布,保护区是典型的高寒森林生态系统,区内有森林、灌丛、湿地和草甸. 森林类型有针叶林、针阔混交林及阔叶林,保护区森林覆盖率高达82.4%[17]. 主要植物有兴安落叶松(Larixgmelinii)、紫椴(Tiliaamurensis)、钻天柳(Choseniaarbutifolia)、白桦(Betulaplatyphylla)、黑桦(BetuladahuricaPall.)、蒙古栎(Quercusmongolica)、山杨(Populusdavidiana)、稠李(Prunuspadus)、大黄柳(Salixraddeana)、东北赤杨(Alnusmandshurica)等.
1.2 研究方法
1.2.1样地设置和样品采集
于2019年7月进行样品采集,在保护区内选取白桦林、蒙古栎林、兴安落叶松林3种典型的森林类型,每种森林类型内设置3块样地,每个样地面积约400 m2,每个样地内分别再设置3个10 m×10 m的小样方.
采用五点采样法采集表层(0~20 cm)土壤,混合为1个土样. 采集后的土壤样品首先剔除植物凋落物,然后过口径为2 mm的土壤筛后放入自封袋中,置于4 ℃保温箱中保存,带回实验室. 在实验室内将土壤样品分成2份,一份用于Biolog-Eco分析,一份室温风干后用于土壤理化性质测定.
1.2.2土壤理化因子测定
土壤pH采用水浸提电位法(水土比2.5∶1)测定;w(SOC)和w(TN)采用元素分析仪(Elementar, Vario MAX CN, Germany)测定.
1.2.3土壤微生物群落功能多样性的测定
首先将土壤样品在25 ℃的恒温箱活化24 h,然后称取10.0 g鲜土加入到无菌的200 mL三角瓶中,再向三角瓶中加入100 mL 0.85%无菌氯化钠溶液,用密封袋封口,室温条件下,180 r/min振荡30 min,静置2 min后依次稀释至10 mL和1 mL土壤悬浮液. 用移液器吸取150 μL土壤悬浮液于Biolog-Eco板中,25 ℃下培养,每组试验均3次重复,590 nm处测定吸光度,每隔24 h测定1次吸光度,连续测定10 d[18-20].
1.3 数据分析
平均颜色变化率(average well color development, AWCD)计算公式:
(1)
式中,Ci为有碳源孔的吸光度值,R为对照孔的吸光度值,Ci-R≤0的孔在计算中记为0[21].
将培养216 h的数据用于计算土壤微生物群落功能多样性,计算公式:
Shannon-Wiener多样性指数[21]:
H=Pi×lnPi
(2)
Simpson优势度指数[21]:
(3)
McIntosh多样性指数[22]:
(4)
式中,Pi为第i个孔的相对吸光度值与所有孔相对吸光度值总和的比值,ni为第i孔的相对吸光度值[23].
数据分析采用Excel 2003和SPSS 17.0进行,采用SPSS 17.0进行单因素方差分析,检测水平选择0.05水平,采用R语言进行热图、主成分分析(PCA)和典型相关分析(CCA),数据包采用Vegan软件包.
2 结果与讨论
2.1 土壤理化性质
如表1所示,3种森林类型土壤pH、w(SOC)、w(TN)之间差异显著(P<0.05). 其中,白桦林土壤pH最高,为6.03,落叶松最低,为4.39;白桦林的w(SOC)最高,为114.11 g/kg,落叶松林最小,为95.04 g/kg;白桦林w(TN)最高,为6.21 g/kg,而落叶松林最小,为4.69 g/kg;落叶松的C/N最高,为20.25,而白桦林C/N最小,为18.37.
表1 土壤理化性质
图1 3种森林类型土壤微生物AWCD值的变化
2.2 土壤微生物AWCD的差异
AWCD表征微生物群落碳源利用率,是土壤微生物群落利用单一碳源能力的重要指标,反映了土壤微生物活性和功能多样性[24-25]. AWCD值越大,表明土壤微生物的密度和活性越高;AWCD值越小,微生物密度和活性越低. 如图1所示,3种森林类型土壤微生物AWCD值的变化规律随着培养时间的延长而增加. 培养24 h后,土壤微生物适应了Biolog-Eco微孔板的基质环境,所有土壤微生物的AWCD值都急剧增加,表明所有土壤微生物群落都能够在Biolog-Eco微孔板中代谢有机底物. 在24~216 h的培养期间,AWCD值增速更快,并且在216 h后趋于稳定,表明所有可培养的微生物都可以在稳定时期内稳定地使用碳源[26].
在3种森林类型土壤中,阔叶林(白桦林和蒙古栎林)土壤微生物的AWCD值均高于针叶林(兴安落叶松林). 216 h后,白桦林和蒙古栎林土壤微生物的AWCD值分别从0增至0.8和0.7,而落叶松林的AWCD值增至0.6左右,表明阔叶林土壤微生物中活性较高. 然而,当落叶松林AWCD值趋于稳定时,其AWCD值增至0.6左右,说明落叶松林的土壤微生物活性最低. 综上,不同森林类型下,土壤微生物的AWCD值不同,土壤微生物群落对碳源的利用能力大小表现为白桦林>蒙古栎林>落叶松林.
2.3 土壤微生物代谢多样性
从表2可以看出,3种森林类型土壤微生物的Shannon-Wiener指数和McIntosh指数差异显著(P<0.05),但是Simpson指数差异不显著(P>0.05),Shannon-Wiener指数呈白桦林>蒙古栎林>落叶松林的规律,白桦林的Shannon-Wiener指数最高,为3.05;McIntosh指数呈蒙古栎林>白桦林>落叶松林的规律,蒙古栎林的Mclntosh指数最高,为9.28.
表2 土壤微生物碳代谢功能多样性
2.4 土壤微生物利用不同底物的能力
根据碳源生理生化特征,Biolog-Eco的31个碳基质可以分为6类——糖类、氨基酸、酯、醇、胺和酸[27](见表3). 如图2所示:代谢指纹图谱中AWCD>2.0的碳源在白桦林土壤中有7种,包括i-赤藓糖醇、D-甘露醇、肝糖、β-甲基-D-葡萄糖苷、N-乙酰-D-葡萄糖胺、L-苏氨酸、吐温40,其中i-赤藓糖醇的AWCD值最高,为 2.776 0;蒙古栎林土壤中有5种,包括L-天门冬酰胺、吐温40、L-丝氨酸、D-甘露醇、吐温80,其中L-天门冬酰胺的AWCD值最高,为 3.050 8;落叶松林土壤中有6种,包括D-甘露醇、β-甲基-D-葡萄糖苷、α-D-乳糖、吐温40、N-乙酰-D-葡萄糖胺、苯乙胺,其中D-甘露醇的AWCD值最高,为 2.832 4.
由图3可见,该研究中土壤微生物群落代谢活性的热图结果可以分为4类:在Ⅰ类群中,落叶松林中2-羟基苯甲酸、D,L-α-磷酸甘油的AWCD值高于白桦林和蒙古栎林;在Ⅱ类群中,白桦林中D-甘露醇、β-甲基-D-葡萄糖苷、N-乙酰-D-葡萄糖胺的AWCD值显著高于落叶松林和蒙古栎林;在Ⅲ类群中,落叶松林中D-木糖、α-D-乳糖的AWCD值显著高于白桦林和蒙古栎林;在Ⅳ类群中,蒙古栎林肝糖、i-赤藓糖醇的AWCD值显著小于白桦林和落叶松林. 这表明不同森林类型土壤微生物的活性和碳源利用偏好有着显著的不同.
2.5 土壤微生物群落的主成分分析
将不同样本的多元向量通过主成分分析(principal component analysis,PCA)转换为互不相关的主成分,可以利用点的位置形象直观地在降维后的主元向量空间中反映出不同微生物群落对碳源的代谢特点,可以客观准确地解释微生物对碳源利用的多样性[28]. 主成分的荷载值越高,意味着碳源对主成分的影响越大. 如表3所示,构成第一主成分(PCA1)的碳源有20种,包括4种糖类、6种氨基酸类、3种酯类、3种醇类、3种胺类、5种酸类,其中L-苯基丙氨酸是与PCA1(荷载值为0.996,见表3)最相关的碳源. 因此,L-苯基丙氨酸对PCA1产生了主要影响. 此外,构成第二主成分(PCA2)的碳源有9种,包括4种糖类、1种氨基酸类、1种酯类和3种酸类,其中D-木糖是与PCA2(荷载值为0.994,见表3)最相关的碳源. 因此,L-苯基丙氨酸和D-木糖是对土壤微生物碳代谢活性具有重要影响. 主成分分析结果表明,PC1和PC2的方差贡献率分别为38.81%和30.30%(见图4). 整体来看,白桦林、蒙古栎林和落叶松林的土壤微生物群落功能存在显著差异(见图4).
2.6 土壤微生物碳源利用模式的差异及其影响因素
通过典型相关性分析对影响土壤微生物群落活性与森林土壤功能多样性的环境因素进行研究. 结果(见图5)显示,前两个CCA轴分别解释了方差的35.67%和22.48%,第一CCA轴与土壤pH呈极显著正相关(r=0.972 3),第二个CCA轴与w(SOC)(r=0.792 8)、w(TN)(r=0.799 8)均呈显著正相关. 总体来看,3种森林类型土壤微生物群落功能主要受到土壤pH、w(SOC)和w(TN)的影响.
土壤微生物功能多样性指数与土壤理化性质之间的关系如表4所示. 从表4可以看出,对于土壤理化性质,AWCD值与pH(r=-0.787,P<0.05)呈显著负相关;Shannon-Wiener指数与w(SOC)(r=0.773,P<0.05)呈显著相关,与w(TN)(r=0.880,P<0.01)呈极显著正相关.
表3 31种碳源主要成分的荷载系数
2.7 讨论
2.7.1不同森林类型土壤理化性质的变化
森林类型的不同会导致凋落物和根系分泌物产生差异,凋落物和根系分泌物会对土壤理化性质产生影响,从而影响土壤微生物的结构和功能. 有研究表明,凋落物和根系分泌物对土壤微生物结构组成具有显著影响[29]. 因此,研究不同森林类型中土壤理化性质和土壤微生物之间的关系,对于了解植被改变后土壤生态系统功能的改变十分重要. 该研究地点位于黑龙江黑嘴松鸡国家自然保护区内,其森林系统属于大小兴安岭森林交错区,而且由于人为干扰和破坏,目前该地区森林以次生演替中的阔叶树种和原始兴安落叶松为主,不同类型植被交错分布,是研究森林改变后土壤生态系统功能的良好区域.
该地区土壤pH呈酸性,范围为4.39~6.03. 其中,落叶松林的土壤pH最低,为4.39,而白桦林的土壤pH最高,为6.03. 这些差异可能与不同凋落物的化学成分差异有关[30]. 与其他2种森林类型相比,落叶松林凋落物质量低,TN含量低,C/N高,木质素含量高,木质素/氮高. 因此,落叶松林凋落物的分解速度和植物养分的释放速度逐渐减慢[30]. 这可能是造成落叶松林下土壤pH较低的原因. 此外,该研究还发现,与针叶林相比,阔叶林(白桦林和蒙古栎林)生态系统中w(SOC)和w(TN)更高(见表1). 这与已有研究结果[31]一致,即阔叶林的土壤有机质和氮含量高于针叶林. 而且,一些研究也发现针叶林中的土壤养分含量低于阔叶林[32-33]. 阔叶林中w(SOC)和w(TN)高可能是因为其凋落物的持续输入、根系效应以及土壤养分的周转[34];而落叶松林中的凋落物含有大量难分解的木质素和有机酸,因此与阔叶凋落物相比,落叶松林的凋落物更难分解. 有研究[35]表明,土壤C/N会影响土壤微生物的结构和功能. 该研究中,落叶松林中土壤C/N显著高于白桦林,这与之前的研究结果不尽一致,有研究[36-37]表明,针叶林土壤中的有机碳含量更高,且具有较高的C/N. 这可能是因为该研究中落叶松林的群落类型单一,其凋落物成分单一,主要凋落物中的化学成分对土壤化学性质产生了显著影响[38]. 已有研究[39-41]表明,地上树种的组成比例会对土壤产生显著影响,这与笔者所得结果一致.
注:B2为D-木糖;H1为α-D-乳糖;A2为β-甲基-D-葡萄糖苷;G2为α-D-葡萄糖-1-磷酸;E1为α-环式糊精;F1为肝糖;G1为D-纤维二糖;A4为L-精氨酸;B4为L-天门冬酰胺;C4为L-苯基丙酰胺;D4为L-丝氨酸;E4为L-苏氨酸;F4为甘氨酰-L-谷氨酸;B1为丙酮酸甲酯;C1为吐温40;D1为吐温80;A3为D-半乳糖酸-γ-内脂;C2为i-赤藓糖醇;D2为D-甘露醇;H2为D, L-α-磷酸甘油;G4为苯乙胺;H4为腐胺;E2为N-乙酰-D-葡萄糖胺;B3为D-半乳糖醛酸;F2为D-葡萄糖胺酸;C3为2-羟基苯甲酸;D3为4-羟基苯甲酸;E3为γ-羟基丁酸;F3为衣康酸;G3为α-丁酮酸;H3为D-苹果酸. 下同.
注:图中红色表示对应样本AWCD值较高,绿色表示AWCD值较低. 图例数值表示多组数据之间的差异程度.
图4 碳源利用图谱主成分分析
2.7.2不同森林土壤微生物功能多样性的变化
目前应用最为广泛的群落多样性指数为Shannon-Wiener指数和Simpson指数,主要用来衡量土壤微生物多样性[42]. 通过对不同森林类型土壤微生物功能多样性的研究表明,森林所导致的次生演替显著改变了土壤微生物alpha功能多样性(见表4). 该研究发现,阔叶林(白桦林和蒙古栎林)土壤微生物的Shannon-Wiener指数显著高于针叶林(落叶松林),这与DENG等[43]的研究结果一致,其研究表明在温带森林生态系统,针叶林土壤微生物的Shannon-Wiener指数低于针阔混交林和阔叶林. 这说明土壤微生物功能多样性与树种相关,不同森林类型通过土壤理化性质的差异会对土壤微生物功能多样性产生影响[44]. 由于兴安落叶松林林分单一,凋落物主要以难分解的针叶为主,有机碳含量低,因此其供微生物利用的碳源也低,因此导致土壤微生物功能多样性降低. 而与兴安落叶松林相比,白桦林和蒙古栎林植被组成复杂,凋落物种类多,而且分解速度快,可以提供大量土壤微生物可以利用的碳源,因此白桦林和蒙古栎林的土壤微生物功能多样性较高.
2.7.3不同森林类型土壤微生物碳源利用的变化
不同森林类型土壤微生物利用单一碳源时会出现一定差异. 该研究中落叶松林中土壤微生物对4-羟基苯甲酸、D,L-α-磷酸甘油具有较高的利用能力,而白桦林中土壤微生物对L-丝氨酸、γ-羟基丁酸、L-苏氨酸、D-半乳糖醛酸的利用效率较高,而蒙古栎林中土壤微生物对肝糖、i-赤藓糖醇的利用效率较高. 森林环境、土壤状况以及植物群落的差异导致土壤微生物对各类底物的适应发生了变化[45]. 森林类型不同,其植物组成和相对丰度均不相同,不同森林类型中植物群落对环境的改变,尤其是土壤环境中微生物群落组成和结构的改造存在较大差异,进而导致微生物功能的改变,因此,表现为对不同碳源种类在利用能力上存在差异. 例如,曹宏杰等[46]研究表明,在不同植被演替阶段,土壤微生物对碳源的利用率显著不同,植物通过根系和凋落物向土壤中释放大量有机物,为土壤微生物代谢活动提供大量碳源,在提供微生物繁殖所需养分的同时,会不断改变土壤理化性质,进而对土壤微生物功能产生显著影响. 因此,不同植被类型下土壤微生物群落组成结构差异尤其是功能菌群的差异可能是引起微生物代谢功能改变的重要原因[47]. 此外,不同森林类型下优势碳源类型的差异反映了土壤微生物呼吸代谢底物的差异,这也反映出生态系统在演化过程中,植被群落结构和类型的差异、演替会影响土壤微生物的群落结构和功能[31]. 这种影响主要取决于凋落物组成和数量的变化,凋落物作为土壤有机质输入的主要来源,其性质和数量等的变化必然会影响土壤微生物群落组成[48-49],从而影响土壤微生物的代谢功能.
图5 土壤微生物群落功能和环境因子的典型相关分析
表4 土壤环境因子与土壤微生物功能多样性的相关性
2.7.4不同森林类型土壤微生物功能多样性与土壤理化之间的关系
该研究表明,w(SOC)、w(TN)均与土壤微生物的Shannon-Wiener指数呈正相关,而土壤pH与土壤微生物的AWCD值呈负相关,这与邓娇娇等[28]的研究结果不尽一致. 这表明该研究区域具有与温带森林生态系统不一致的特点,说明其受到了寒温带森林生态系统的影响. 森林植被发生演替后,会造成不同数量和质量的植物凋落物输入土壤[50-52],而不同植物种类之间的凋落物质量和数量将为土壤中不同种类的微生物提供支持[53-54]. 综上,由于不同森林类型的凋落物组成差异所导致的土壤理化性质差异是影响土壤微生物结构和功能的主要原因.
土壤微生物是森林生态系统的重要组成部分,研究不同森林植被演替下植被变化与土壤微生物多样性之间的相互影响,对于揭示土壤微生物、环境、植物之间的关系意义重大. Biolog-Eco法由于碳源种类等的限制不能全面地反映微生物的功能和多样性,因此需要结合酶动力学、分子生物学尤其是高通量测序等手段,深入研究地上植被类型、组成和多样性与土壤微生物结构、功能和多样性的关系,探讨森林类型对土壤微生物群落结构和功能的相对贡献.
3 结论
a) 黑龙江中央站黑嘴松鸡国家级自然保护区内森林交错区生态系统不同森林植被演替阶段土壤微生物多样性和功能发生了显著改变. 阔叶林土壤微生物的Shannon-Wiener指数显著高于兴安落叶松林,其中白桦林最高,为3.24,兴安落叶松林最低,为2.65. 从PCA和热图分析来看,不同林型土壤微生物对碳源的利用差异显著. 白桦林和蒙古栎林土壤微生物功能活性显著高于原始的兴安落叶松林.
b)w(SOC)和w(TN)是影响土壤微生物群落功能多样性的主要因素,长期的森林植被演替改变了w(SOC)和w(TN),从而影响了土壤微生物的功能多样性.
致谢:感谢黑龙江中央站黑嘴松鸡国家级自然保护区服务中心赵振柱主任、陈福元科长和李显达科长在试验设计和野外工作中提供的帮助.