基于喹喔啉酮结构的醛糖还原酶抑制剂的设计合成与构效关系研究

马兵， 范振亚， 王杏， 李晨颖， 朱长进

(北京理工大学 化学与化工学院，北京 102488)

糖尿病是由多种致病因子引起的代谢紊乱综合征[1]. 多元醇通路机理是最早提出的、被公认为最具有说服力的糖尿病并发症发病机制. 在高血糖情况下(>7 mmol/L)，约占葡萄糖代谢总量1/3的葡萄糖通过多元醇通路进行代谢[2-3]. 葡萄糖多元醇代谢通路的第一步需要醛糖还原酶以及辅酶磷酸酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)的催化[4-5]. 醛糖还原酶抑制剂可以抑制ALR2的活性，是一类很具有研究意义的药物[6].

喹喔啉酮具有抗血栓、消炎等多种生物活性，是药物化学中的一种十分重要的结构[7-8],前期研究发现喹喔啉酮衍生物表现出了一定的醛糖还原酶抑制活性[9-11]. 本文以喹喔啉酮为母核，通过侧链设计，合成了一系列羧酸类醛糖还原酶抑制剂，研究侧链长度和醛糖还原酶抑制活性之间的构效关系.

1 实验部分

1.1 实验仪器

熔点仪：X-4 型显微熔点仪；核磁共振仪：Bruker Ascend 400M；高分辨质谱仪：AGILENT LC/MS ；紫外/可见双光束分光光度计：Unico 4802S；高效液相色谱仪：Hitachi D-2000.

1.2 化学合成

1.2.1 2-(3-氯-2氧喹喔啉-1(2H)-烷基)乙酸甲酯(2)的合成

将2.168 g (12 mmol)3-氯-喹喔啉-2(1H)-酮，4.97 g(36 mmol)K2CO3，1.32 mL(14 mmol)溴乙酸甲酯以及30 mL乙腈放入250 mL烧瓶中，在65 ℃加热搅拌，TLC监测原料点消失. 待反应液冷却后，抽滤，减压旋干，将所得固体进行柱层析(PE:EA=3:1)，得到目标化合物2. 白色固体，产率83%.1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ7.84(d,2H),7.67(d,J=6.4 Hz,1H),7.56(d,J=8.4 Hz,1H),5.23(s,2H),3.82(s,3H).

1.2.2 (3-(3-苯丙烯基/4-苯丁烯基)-2-氧喹喔啉-1(2H)-烷基)乙酸甲酯(3a-d)的合成

将2-(3-氯-2氧喹喔啉-1(2H)-烷基)乙酸甲酯2(1.008 g，4 mmol)，醋酸钯(0.046 g，0.20 mmol)和三邻甲基苯基膦(0.086 g，0.28 mmol)加入到装有20 mL DMF的烧瓶中，在氩气保护下，室温搅拌20 min，然后加入3-苯丙烯/4-苯丁烯(6 mmol)和Et3N(12 mL)，保持氩气环境，反应混合物在100 ℃下搅拌12 h. 反应结束后，将反应液倒入分液漏斗，加入20 mL的水并用乙酸乙酯萃取，将萃取液用无水MgSO4干燥，过滤除去干燥剂并将滤液减压旋干，将所得固体进行柱层析(PE:EA=3:1)，得到目标化合物(3a-c).

2-(3-(3-苯丙烯基)-2-氧喹喔啉-1(2H)-烷基)乙酸甲酯(3a)：黄色固体，产率42.6%.1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ8.51(d,J=7.7 Hz,1H),8.12-7.80(m,3H),7.78-7.56(m,3H),7.45(d,J=7.7 Hz,2H),6.98(d,J=6.4 Hz,1H),5.14(s,2H),5.02(d,J=7.3 Hz,1H),3.70(s,3H),3.38(s,2H).

2-(3-(4-苯丁烯基)-2-氧喹喔啉-1(2H)-烷基)乙酸甲酯(3b)：棕黄色固体，产率27%.1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ7.91(d,J=8.4 Hz 1H),7.55(dd,J=7.3 Hz,6.2 Hz,2H),7.37-7.14(m,6H),6.96(d,J=8.6 Hz,1H),5.12(s,2H),4.26(d,J=6.9 Hz,1H),3.71(s,3H),2.94-2.73(m,2H),2.75-2.53(m,2H).

2-(3-(3-(4-甲氧基苯基)丙烯基)-2-氧喹喔啉-1(2H)-烷基)乙酸甲酯(3c)：棕色固体，产率38.6%.1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ8.39(d,J=8.6 Hz,1H),8.16-7.94(m,3H),7.80-7.24(m,4H),6.98(d,J=8.8 Hz,2H),5.37(s,2H),3.94(s,3H),3.87(s,2H),3.63(s,3H).

2-(3-(3-(4-羟基苯基)丙烯基)-2-氧喹喔啉-1(2H)-烷基)乙酸甲酯(3d)：红棕色固体，产率41%.1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ10.37(s,1H),8.39(t,J=8.6 Hz,1H),8.16-7.77(m,3H),7.80-7.24(m,4H),6.98(d,J=8.8 Hz,2H),5.37(s,2H),3.94(s,3H),3.87(s,2H).

1.2.3 2-(3-(3-苯丙基/4-苯丁基)-2-氧喹喔啉-1(2H)-烷基)乙酸甲酯5的合成

将1 mmol化合物3a/3b和10 mL THF加入到100 mL两口烧瓶中，再加入10 mL甲醇以及0.36 g 10% Pd/C，在氢气环境下室温反应12 h，TLC监测至原料点消失，真空泵抽滤除去Pd/C催化剂，减压旋干，将产物柱层析提纯(PE∶EA=5∶1)，得到目标化合物5.

2-(3-(3-苯丙基)-2-氧喹喔啉-1(2H)-烷基)乙酸甲酯(5a):黄色固体，产率52.6%.1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ7.85(d,J=8.5 Hz,2H),7.59-7.05(m,5H),6.85(d,J=7.8 Hz,1H),6.75(d,J=7.5 Hz,1H),5.19(s,2H),3.73(s,3H),2.61(t,J=3.5 Hz,2H),1.53(t,J=3.8 Hz,2H),1.48(t,J=3.6 Hz,2H).

2-(3-(4-苯丁基)-2-氧喹喔啉-1(2H)-烷基)乙酸甲酯(5b):棕色固体，产率43.7%.1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ8.75(d,J=7.4 Hz,2H),7.89-7.65(m,5H),7.42(d,J=6.4 Hz,1H),7.14(d,J=7.5 Hz,1H),5.19(s,2H),3.73(s,3H),1.77(t,J=4.2 Hz,2H),1.53(t,J=4.8 Hz,2H),1.48(t,J=5.3 Hz,2H),1.41(t,J=4.6 Hz,2H).

1.2.4 目标化合物(4a-d，6a-b)的合成

将1 mmol 化合物(3a-d,5a-b)，饱和LiOH溶液加入10 mL四氢呋喃溶液中，在室温下搅拌至TLC监测原料点消失. 反应结束后，滴加10%盐酸溶液调节反应液的pH为2～3，此时析出固体，然后分多次萃取(乙酸乙酯)，合并有机萃取液. 以无水MgSO4干燥，过滤并减压除去溶剂，得到目标化合物(3a-d,5a-b).

2-(3-(3-苯丙烯基)-2氧喹喔啉-1(2H)-烷基)乙酸(4a):黄色固体，产率83%，纯度97.59%，熔点263-266 ℃.1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ12.18(s,1H),8.51-8.24(m,1H),8.12-7.80(m,3H),7.78-7.56(m,3H),7.56 -7.45(m,2H),6.98(d,J=7.7 Hz,1H),5.14(d,J=7.6 Hz,1H),5.02(s,2H),3.38(s,2H).13C NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ168.82,154.12,151.56,141.93,139.82,132.58,130.76,129.61,129.24,129.11,128.53,124.06,116.59,114.58,43.86,36.92. HRMS(ESI)m/zcalcd for [M+H]+321.1234,found 321.1394.

2-(3-(4-苯丁烯基)-2氧喹喔啉-1(2H)-烷基)乙酸(4b):棕黄色固体，产率87.5%，纯度96.53%，熔点240-243 ℃.1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ11.86(s,1H),7.91(d,J=7.4 Hz,1H),7.55(dt,J=6.5,4.3 Hz,2H),7.37-7.14(m,6H),6.96(d,J=6.3 Hz,1H),5.12(s,2H),4.26(d,J=6.9 Hz,1H),2.94(s,2H),2.68(s,2H).13C NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ168.76,154.21,151.44,141.98,139.21,133.42,132.08,129.72,129.21,129.03,125.92,123.95,115.84,114.72,43.84,36.10,34.63. HRMS(ESI)m/zcalcd for [M+H]+334.1391,found 335.1396.

3-(3-(3-(4-甲氧基苯基)丙烯基)-2氧喹喔啉-1(2H)-烷基)乙酸(4c):棕黄色固体，产率76.4%，纯度98.37%，熔点264-266 ℃.1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ12.03(s,1H),8.39(t,J=7.2 Hz,1H),8.16-7.77(m,3H),7.80- 7.24(m,4H),6.98(d,J=6.7 Hz,2H),5.37(s,2H),3.94(s,3H),3.87(s,2H).13C NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ168.45,159.52,157.83,154.32,133.82,133.50,133.31,132.64,130.45,129.82,123.80,115.22,114.38,55.41,44.32,37.14. HRMS(ESI)m/zcalcd for [M+H]+351.1340,found 351.1347.

2-(3-(3-(4-羟基苯基)丙烯基)-2氧喹喔啉-1(2H)-烷基)乙酸(4d):深红棕色固体，产率73%，纯度96.86%，熔点285-287 ℃.1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ12.10(s,1H),10.37(s,1H),8.39(d,J=7.2 Hz,1H),8.16-7.77(m,3H),7.80-7.24(m,4H),6.78(d,J=6.4 Hz,2H),5.37(s,2H),3.87(s,2H).13C NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ168.64,155.52,154.10,151.63,139.90,134.08,132.66,132.21,129.73,129.11,123.72,118.23,115.87,114.31,43.65,36.83. HRMS(ESI)m/zcalcd for [M+H]+337.1183,found 337.1406.

2-(3-(3-苯丙基))-2氧喹喔啉-1(2H)-烷基)乙酸(6a):黄色固体，产率78.9%，纯度98.15%，熔点196-198 ℃.1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ12.02(s,1H),7.85(d,J=8.5 Hz,2H),7.59-7.05(m,5H),6.85(d,J=7.8 Hz,1H),6.75(d,J=7.5 Hz,1H),5.19(s,2H),2.61(t,J=3.5 Hz,2H),1.53(t,J=3.8 Hz,2H),1.48(t,J=3.6 Hz,2H).13C NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ159.65,154.28,142.08,133.24,132.21,130.13,129.35,129.16,128.76,126.44,123.72,115.31,53.82,36.38,32.25,24.62. HRMS(ESI)m/zcalcd for [M+H]+323.1391,found 323.1391.

2-(3-(4-苯丁基)-2氧喹喔啉-1(2H)-烷基)乙酸(6b):棕黄色固体，产率75%，纯度97.74%，熔点190-193℃.1H NMR(400 MHz,DMSOd6)δ9.23(d,J=8.1 Hz,1H),7.79(d,J=7.8 Hz,1H),7.57(t,J=7.6 Hz,1H),7.45(d,J=8.3 Hz,1H),7.36(t,J=7.5 Hz,1H),7.31-7.17(m,5H),4.99(s,2H),2.87(t,J=7.2 Hz,2H),2.64(t,J=7.2 Hz,2H),1.79-1.64(m,4H).13C NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ159.38,154.35,142.63,133.10,132.35,129.42,128.97,128.53,128.14,125.86,123.35,115.61,53.71,36.78,31.72,30.43,23.86. HRMS(ESI)m/zcalcd for [M+H]+337.1547,found 337.1560.

1.3 ALR2活性测试

ALR2提取自大鼠晶状体. 根据Kinoshita J[12]和La Motta C[13]的报道方法制备ALR2，通过分光光度法测定340 nm时NADPH吸收的减少，从而测定酶的活性. 将0.25 mL的NADPH(0.10 mmol/L)，0.1 mL的酶提取液，0.25 mL的磷酸钠缓冲液(0.1 mol/L，pH=6.2)，0.15 mL的去离子水混合均匀，置于30 °C的水浴中孵育10 min. 最后加入0.25 mL的D,L-甘油醛(10 mmol/L)到上述体系中混匀，形成1 mL的反应体系，监测4 min，记录其吸光度. 通过向上述反应体系中加入5 μL DMSO溶解的化合物测定其对ALR2的抑制活性. 大多数化合物的酶抑制率曲线是由至少三种浓度的抑制活性在20%～80%之间生成的，通过对数线性(剂量)与响应曲线的线性最小二乘分析计算出IC50值(r2> 0.95).

1.4 分子对接实验

使用Molegro Virtual Docker Version 5.0软件进行分子对接. 从RCSB蛋白质数据库中检索到的具有结合人醛糖还原酶抑制剂的晶体结构(lidorestat，其PDB代码为1Z3N)用于分子对接. 去除蛋白质结构内的所有溶剂分子以进行对接程序. 目标化合物最初被绘制为二维(2D)化学结构，然后用Chem3D 转化为三维(3D)结构并进行优化. Molegro Virtual Docker软件中有配体的所有结构参数，例如键序，杂化，明确的氢原子和电荷. 为了在蛋白质中获得更好的潜在结合位点，进行了可能的结合腔的检测，并且获得了5个腔. 选择阴离子结合位点周围的空腔进行对接计算. 每个配体获得5种结合确认，并根据结合能(MolDock得分)，氢键和所有化合物的构象相似性选择最相关的一种.

2 结果与讨论

2.1 化合物的合成

喹喔啉酮衍生物的具体合成如图1所示. 3-氯-喹喔啉-2(1H)-酮(1)的合成依据前期的研究工作[14]. 化合物1和溴乙酸甲酯在碳酸钾的作用下发生N烷基化反应得到2-(3-氯-2-氧喹喔啉-1(2H)-烷基)乙酸甲酯(2). 化合物2与3-苯丙烯、4-苯丁烯通过Heck偶联反应，得到化合物3. 将得到的桥连基团为1-丙烯基，1-丁烯基的偶联产物的碳碳双键还原得到C3位桥连基团为正丙基、正丁基的化合物5. 最终，在碱性条件下水解酯类化合物(3a-d,5a-b)，得到N1位为羧酸的喹喔啉酮衍生物(4a-d,6a-b).

图1 目标化合物合成路线图

2.2 生物活性评价

对所有合成的最终产物都进行了ALR2抑制活性实验，确定了喹喔啉酮衍生物的醛糖还原酶抑制活性，epalrestat被用作ARIs阳性对照. 结果如表1所示.

化合物4a-b和7均为喹喔啉酮C3位与芳基侧链以碳碳双键作为桥连基团，测试结果表明3种化合物的醛糖还原酶的抑制活性顺序为4b>4a>7，抑制活性最好的化合物4b的IC50为207 nmol/L，活性最小的化合物7的IC50为870 nmol/L(表1). 由此可以看出连接臂碳链X依次为2、3、4碳原子的化合物都具有明显的抑制活性. 而且，随着碳链长度的增加，抑制活性显示出递增的趋势.

化合物4a-b的C3位1-丙烯基和1-丁烯基桥联基团的碳碳双键经过还原，形成烷基桥联衍生物，如表1所示. 其中，10的活性最强(IC50=143 nmol/L)，高于化合物8，9，6a和6b. 连接臂碳链X的长度分别为4，3，1，0碳原子的4种化合物的抑制活性顺序为6b>6a>9>8. 其活性顺序与上述烯烃桥联化合物的构效研究结果相一致，总的趋势为碳链的延长对醛糖还原酶抑制活性明显增强. 烷基桥联化合物10的活性优于烯烃桥联化合物7，但是，6a-b的活性低于双键还原前的4a-b.

在保持喹喔啉酮C3位与芳基以碳碳双键作为桥连基团的基础上，C3位芳基侧链的对位引入甲氧基或酚羟基，分别形成了甲氧基类衍生物和羟基类衍生物. 如表1所示，甲氧基类衍生物11的桥联碳原子个数为2，其IC50值为246 nmol/L.4c的桥联碳原子数为3，其IC50值为4.181 μmol/L. 此结果又一次证明了碳链的延长对醛糖还原酶的抑制活性的增强作用. 羟基类衍生物包括3个化合物(4d，12和13)，与引入羟基前的对应化合物(4a，8和7)相比，其抑制活性有所提高.同时，羟基类衍生物4d和12的抑制活性也高于甲氧基类衍生物4c和11. 由此证明酚羟基的引入能够提高醛糖还原酶的抑制活性. 对于此类化合物，4d的抑制活性最好(IC50=93 nmol/L)，与目前已上市的epalrestat活性相当(IC50=83 nmol/L).13的抑制活性次之，其IC50为182 nmol/L.12的抑制活性最小，其IC50为2.592 μmol/L. 再次证明了醛糖还原酶的抑制活性是随着碳链长度的增加逐渐增强.

因此，醛糖还原酶抑制活性的测试结果充分表明，喹喔啉酮母核的C3位与侧链的芳环之间的连接链的长度越长，醛糖还原酶抑制活性提升越显著. 而且，芳环上酚羟基的引入能够提高醛糖还原酶的抑制活性.

表1 喹喔啉酮衍生物的ALR2抑制活性

2.3 分子对接模拟

运用分子模拟软件，研究了化合物4d的分子对接，以了解该化合物在ALR2抑制中的机理. 由于4d在结构上与lidorestat相似，因此选取了序号为1Z3N的PDB文件用于分子对接，获得了5个MolDock得分，分别为-133.81，-127.153，-129.944，-129.126，-128.924. 根据结合能，氢键和所有化合物的构象相似性选择最相关的一种，如图2所示.4d能够紧密结合在ALR2的活性位点中，与氨基酸残基Tyr48(0.326 nm)、Tyr111(0.329 nm)和Thr113(0.304 nm)形成氢键作用并与辅因子NADP+的带正电烟酰胺部分形成稳定地静电相互作用，从而羧基能够很好地插入阴离子腔. 此外，C2位的羰基结构也能与氨基酸残基Cys298(0.268 nm)形成氢键作用，这也直接影响化合物与酶的结合. C3位置上的芳环平面与氨基酸残基Trp111上的吲哚环相邻平行，相互间形成π-π叠加作用. 而且，较长的侧链能够很好地进入到由氨基酸残基Trp111，Leu300，Phe122，Cys303，Thr113，Phe115以及Trp79所形成的特异性口袋形成疏水相互作用.

分子对接研究表明目标化合物与醛糖还原酶的活性位点结合紧密. 因此，目标化合物的设计是合理的.

图2 化合物4d和ALR2的活性位点对接

3 结 论

本文选择以喹喔啉-2(1H)-酮为母核结构，重点修饰母核C3位侧链的长度，设计合成了一系列喹喔啉酮衍生物作为醛糖还原酶抑制剂，并对其ALR2的抑制活性进行了检测. 构效关系研究表明，C3位侧链的延长以及侧链芳环酚羟基的引入有利于提高化合物的抑制活性. 其中，化合物4d表现出了较好的抑制活性(IC50=93 nmol/L)，与目前上市的epalrestat活性相当(IC50=83 nmol/L). 最后，运用分子对接软件从分子水平上论证了目标化合物设计的合理性. 本研究对进一步设计强效的醛糖还原酶抑制剂具有重要的指导意义和参考价值.