基于文献数据库的慢性不可预见性温和应激诱发抑郁症动物模型研究

李杉杉刘新民*王 琼

(1.西南医科大学附属中医医院中葡中医药国际合作中心/药学院,四川 泸州 646000； 2.中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所,北京 100193； 3.中国农业科学院农产品加工研究所,北京 100193)

抑郁症是一种复杂的疾病,临床表现为多系统损伤症状,涉及多种身心症状[1],严重影响患者的健康。 而高达三分之一的抑郁症患者对传统抗抑郁药[2]反应不良。 因此,迫切需要开发更安全、更有效的抑郁症治疗方法,而动物模型是进行发病机制研究及药物开发的基础手段。

慢性不可预见性温和应激(chronic unpredicted mild stress, CUMS)模型是常见的研究抑郁症的模型,其理论依据为动物处于不适宜生存的环境时会出现紧张、焦虑和抑郁等症状,而长期、慢性、不可预计的刺激可以加快抑郁症的发展。 最初的形式是慢性不可预见性应激(chronic unpredicted stress,CUS),由Katz 等[3]在20 世纪80 年代初对此模型进行了一系列研究,后来Willner 等[4]在此基础上发展了慢性不可预见性温和应激模型(CUMS)。CUMS 抑郁模型具有高度的有效性,并可持续几个月,基本符合抑郁模型的要求,是目前国内外文献中广泛使用的模型[5-6]。 在临床前研究中也得到了广泛的应用,有良好的表现、结果和预测效度,具有模拟病因的有效性。 本文通过查阅CNKI 和PubMed 两大常用数据库的相关文献资料,对10 年来慢性不可预见性温和应激进行了归纳和整理,从造模动物、CUMS 模型刺激因子、造模时长等方面进行总结,为CUMS 模型在抑郁症研究中的使用提供参考。

1 材料和方法

1.1 实验材料

使用CNKI 和PubMed 两大常用数据库进行文献检索。

1.2 实验方法

CUMS 相关文章发表的研究调查利用CNKI 的中国学术文献网络出版总库进行文献检索。 点击“高级搜索”,在“主题搜索”中输入“CUMS”,同时应用“并含”输入“大鼠”,时间设定为2010 年1 月1日-2020 年4 月30 日,检索有关大鼠慢性不可预见性温和应激方面的中文文献；同样的在“主题搜索”中输入“CUMS”,同时应用“并含”输入“小鼠”,检索有关小鼠慢性不可预见性温和应激方面的中文文献。 用PubMed 以“CUMS”为关键词进行文献检索,检索同样时间段的慢性不可预见性温和应激相关的英文文献。 当研究符合以下纳入标准时被计为有效文献:(1)以原始文章的形式发表的期刊,会议文章、综述剔除；(2)实验中有空白组和模型组,并且模型组只使用了CUMS 模型；(3)造模时长以及刺激因子描述完整；(4)使用了行为学检测,并且有行为学结果；(5)动物品系、雌雄描述清楚,使用未转基因或未接受产前应激或绝育的啮齿动物。

1.3 统计学方法

通过汇总所有纳入研究的文献,全文阅读审查所要研究的数据,统计相关的文献数并计算占比。图形由GraphPad Prism 5, GraphPad Software 提供。

2 结果

2.1 CUMS 相关文献发表情况

获得CUMS 相关的中英文文献共有1755 篇,其中有关慢性不可预见性温和应激方面的中文文献共有1076 篇(大鼠788 篇,小鼠288 篇),有关慢性不可预见性温和应激相关的英文文献共有679 篇。对这1755 篇论文进行全文评估后,发现有效文献共有679 篇,其中英文文献有424 篇,中文文献有255篇。 有效文献中CUMS 大鼠模型492 篇,CUMS 小鼠模型187 篇。 有效文献中进行药效学研究的有420 篇,其中CUMS 大鼠模型292 篇,CUMS 小鼠模型128 篇。 具体分布情况如图1。 可见每年发表文献逐年上升,其中2018 年及2019 年发表文献最多。

2.2 CUMS 模型建立的调查结果

2.2.1 CUMS 模型动物的选择

从图2A 可见,95.3%的CUMS 造模都选择雄性鼠。 有文献报道雄性大鼠对慢性应激更敏感[7],但也有文献认为慢性应激更易致雌性大鼠产生抑郁样行为[8],同时还有文献报道慢性应激对不同性别的大鼠所致的抑郁样行为没有差异[9]。

关于大小鼠的选择,84.4%的研究选择了大鼠,选择小鼠的只有15.6%。 对于大鼠,除了个别实验使用到Charles-Foster、Long-Evans 和GK 大鼠,大部分使用了SD、Wistar 大鼠(图2B),而有文献称Wistar 大鼠较SD 大鼠更敏感[10]。 对于小鼠,除了个别实验使用到NMRI 和CD-1 小鼠,大部分使用了C57BL/6、昆明、ICR、BALB/c、Swiss 小鼠(图2C)。其中,BALB/c 小鼠属于敏感小鼠,C57BL/6 属于不敏感小鼠[10]。

2.2.2 CUMS 刺激因子的选择与使用情况

在CUMS 造模过程中,刺激因子的多变性、不可预见性是模型成功的关键,单独使用一种刺激不能产生理想的效果,每种刺激因子应间隔3 ～7 d[11]。具体的CUMS 造模中刺激因子及其使用情况如图3所示。

图1 CUMS 相关文献按年份的分布情况Figure 1 Distribution of CUMS related literature by year

从图3A 可见,68.5%的CUMS 造模过程都选择了7～9 种刺激因子,只有少数实验选择了≥12 或≤6 种的刺激因子,最少的用了5 种[12],最多的用了15 种[13]。

从图3B 可见,使用频率排前十的刺激因子依次为禁水、禁食、潮湿垫料、冰水游泳、笼倾斜、夹尾、束缚、昼夜颠倒、持续照明、水平振荡。 大小鼠使用频率排前十的刺激因子是一样的,只是排序有差异。 图3B 罗列的是使用频率大于10%的刺激因子,图3C 罗列的是使用频率小于10%的刺激因子。除此之外,还有部分少见的刺激因子,如腹腔注射生理盐水、从高处落下、高台刺激、白光照射、交换鼠笼、强光照射等。

(1)饮食和饮水供应的调整

禁食、禁水是最常见的刺激因子,因其操作简单而刺激强度较大。 实验中的禁食有三种类型:单独禁食(77.6%)、禁食禁水同时进行(20.7%)、禁食后限制进食(1.7%)；禁水也有三种类型:单独禁水(75.4%)、禁食禁水同时进行(20.5%)、禁水后空瓶(4.1%)。 禁食的刺激时长85.5%为24 h[14],8.1%为12 h[13],8.1%为48 h[15]。 禁水的刺激时长80.5%为24 h[14],8.2%为12 h[15],值得注意的是禁水与潮湿垫料一般不同时进行,因为潮湿垫料中有水。 禁食禁水的刺激时长一般为24 h[16],而禁食禁水后控制饮食时长一般为禁食或禁水23 h 后限制进食或空瓶1 h[17]。 空瓶刺激是一种将水倒掉只留瓶子在鼠笼上的一种应激方式,在使动物体感饥渴的同时,更能使动物焦虑,约80%的刺激时长为1 h[18]。

注:A:动物性别使用占比；B:大鼠品系使用占比；C:小鼠品系使用占比。图2 CUMS 模型中动物的性别、品系使用情况Note. A, The usage proportion of animal sex, B, The usage proportion of rat strain, C, The usage proportion of mouse strain.Figure 2 The usage of animal sex and strain in CUMS model

(2)居住环境的改变

居住环境改变常见的有配对、拥挤、鼠笼倾斜、潮湿垫料,少见的有单笼饲养[17]和空笼[14]。 在配对或拥挤刺激中,常见的是将两只原本单笼饲养的动物放置在同一个鼠笼中,也有实验者将多于2 只动物放置在一个笼子,刺激时长一般为12 h[19]或24 h[13]。 鼠笼倾斜的角度一般为45°,也有少数实验中选择30°[20]或60°[21]。 对于倾斜45°而言,刺激时长多数为24 h[14],少数为12 h[17]。 潮湿垫料的一般操作方式为,将200 mL 水倒入装有100 g 垫料的鼠笼中,约60%的刺激时长为24 h[13],少数为12 h[19]。 另外,笼倾斜与潮湿垫料常被运用到同一个实验内,有时甚至同时应用[22]。

注:A:CUMS 模型中刺激因子使用量；B:常见的刺激因子(使用频率10%～100%)；C:常见的刺激因子(使用频率1%～10%)。图3 CUMS 模型中刺激因子的使用情况Note. A, The number of stimulating factors in CUMS model. B, Popular stimulation factors (frequency 10%～100%). C, Popular stimulation factors(frequency 1%～10%).Figure 3 Usage of stimulating factors in CUMS model

(3)昼夜节律的重新调整及光照性质改变

常见的有昼夜颠倒、持续照明、频闪,少见的有间歇光照、黑暗应激[20]和白光照射[20]。 频闪频率一般为60 ～150 次/分[17],时长一般为12 h[23]并且在夜间进行。 昼夜颠倒操作即为白天关灯12 h,夜晚开灯12 h[14]。 持续照明多数为通宵持续照明[16]。 间歇照明较少见,一般持续10 ～24 h,大部分是以2～3 h 为一个循环[23],少数是以1 h 为一个循环[13]。

(4)游泳

游泳一般有冷水游泳,热水游泳,强迫游泳三种应激方式。 冷水游泳主要是使实验鼠接受冷的刺激,大部分为在4℃～6℃的水中游泳5 min[13]。热水游泳主要是使实验鼠接受热的刺激,大部分为在40℃～45℃的水中游泳5 min[13]。 而单纯的强迫游泳主要是使动物疲劳,一般为在20℃～25℃[24]水中游泳几分钟至1 h 不等。 实验中常用的应激因子是前两种。

(5)温度调整

温度变化一般分为高温刺激或低温刺激。 高温环境刺激是将实验鼠移至温度比较高的房间或烘箱中,温度一般为42℃～50℃,刺激时长一般为5～15 min[19]。 值得注意的是高温环境刺激与热水游泳一般不在实验中同时出现。 低温刺激即将房间温度调至0℃～5℃,刺激时间一般为1～2 h[19]。

(6)其余应激方式

夹尾是将夹子夹在实验鼠尾巴上使其疼痛的一种应激方式,多数实验选择夹在距离尾根1 cm处,应激时长一般为1 ～3 min[16]。 束缚是限制动物活动的一种应激方式。 应激时长一般为1 ～6 h,44.2%的实验束缚2 h[14]。 水平振荡是将动物放置在鼠笼中,使用手动或机器的方式使其在水平面高速振荡的一种应激方式。 刺激时间多为5 ～15 min,频率在60～160 rpm 之间[14-15]。 噪音干扰一般有4种:捕食者声音,一般使用时间为30 min[25]；超声[26]应激时长为1～24 h 不等；白色噪音,分贝一般在60～120 dB[17],使用时间一般为1 ～12 h；以及实验鼠尖叫声[20]。 前三者较常见,而最后一种刺激少见。 电击常用短时间电击足底[26]、少数采用电击耳朵[22]。 常用的强度为1 ～15 mA,60 ～70 V,一般每次电击5～10 s,间隔10～50 s,共15～30 次。 陌生异常物体如塑料杯、勺子、碎布片等在鼠笼中放置,会使动物产生焦虑和恐惧,应激时长一般为24 h[24]。悬尾刺激是使动物处于倒悬位的一种刺激方式,应激时长一般为1 ～5 min[24]。 气味刺激的应激时长一般为1～3 h[16,27]。

2.2.3 CUMS 造模时长及每日刺激次数的使用情况

如图4A 所示,造模3～4 周占大部分(58.8%),造模时间最短为11 d,每天给予2 种刺激因子[28],造模时间最长为14 周,每天给予一种刺激因子[29],还有少数为分段造模[18]。 从图4B 可见,95.5%的CUMS 造模过程,每天都只安排1 ～2 种刺激因子[23],少数实验者采用每天3 ～4 种刺激因子[19]。造模时长为3 ～4 周的实验中,81.8%每天给予1 种刺激因子,2.6%每天给予3 ～4 种刺激因子；造模时长为5～8 周的实验中,60.5%每天给予1 种刺激因子,9.2%每天给予3～4 种刺激因子。

对于造模后,研究抑郁状态的持续时长的文章,统计发现共有66 篇。 其中研究造模3 周后抑郁持续时间的文章最多,共31 篇,4 周的次之,有20篇。 给予刺激因子3～4 周后,撤出刺激因子后抑郁可以持续3 ～4 周[14,30],有些甚至持续5 周[31]。 可见撤出刺激因子后抑郁状态持续时长可与刺激时长持平,甚至长于刺激时长。

2.3 CUMS 行为学检测的研究调查

图5 是大小鼠都会使用到的行为学检测的使用频次排序。 我们可以看出,在实验中用到糖水偏好实验(SPT)的频率最高,其次有旷场实验(OFT)、强迫游泳实验(FST)、悬尾实验(TST)、水迷宫实验(MWM)、高架十字迷宫实验(EPM)、新奇抑制摄食实验(NSFT)等行为学检测。 除此之外,少数小鼠用到辐射臂迷宫实验、嗅觉鉴别实验、嗅觉灵敏度实验、巴恩斯迷宫、高架零迷宫测验、社会交互实验等行为学测试。 少数大鼠用到机械痛觉过敏实验、热痛觉过敏实验、被动回避实验、热板实验、跳台实验等行为学测试。

注:A:CUMS 造模时长分布图；B:每日刺激数使用占比。图4 CUMS 模型中造模强度使用情况Note. A, Distribution of modeling duration in CUMS model, B, Usage proportion of daily stimulating factors.Figure 4 Usage of modeling strength in CUMS model

图5 CUMS 模型中行为学测试使用频率分布图Figure 5 Frequency distribution of behavioral tests in CUMS model

CUMS 抑郁模型主要模拟了人类抑郁的核心症状——快感缺失。 统计发现在大小鼠中最常用的行为学检测都是糖水偏好实验,糖水偏爱指数作为测量CUMS 抑郁模型快感缺乏的有效客观指标。 强迫游泳实验和悬尾实验既是应激性抑郁动物模型的造模方法,也是抑郁动物模型常用的检测方法；而旷场实验可用于评价各类应激性抑郁动物模型的自主运动行为、探究行为和紧张度,从而反映抑郁程度。 此4 种行为学检测使用频率都大于10%。值得注意的是悬尾实验共使用了141 次,其中小鼠108 次(在小鼠中使用频率为57.8%)、大鼠33 次(在大鼠中使用频率为6.7%)。 而运用到强迫游泳实验的实验中,只有3.0%使用到了强迫游泳这种刺激因素。 CUMS 不仅可以导致抑郁,也可导致认知障碍与焦虑,所以部分实验也用到了水迷宫实验与高架十字迷宫实验。

不同的行为学检测出现显著性差异的时间不同。 糖水偏爱实验[32]和旷场实验[32]最早为1 周,强迫游泳实验[33]、悬尾实验[33]与高架十字迷宫实验[34]最早为2 周,水迷宫实验[19]与新奇抑制摄食实验[25]最早为3 周。

3 讨论

长期不良事件刺激与抑郁症的发生有明确关系,且不良事件越多,抑郁症的发生率越高[35]。CUMS 模型可以模拟生活中的不同应激源,使得动物产生抑郁症状,与人类患抑郁症的历程有相似性。 本文综述了造模动物、CUMS 模型刺激因子、造模时长,希望为今后CUMS 造模提供一些参考:(1)雄性大鼠的使用频率较高,若无特殊要求可以选择雄性大鼠；(2)为了使动物不可预知刺激,刺激因子选择7 ～9 种比较合适,3 ～7 d 内不重复,但如果实验条件允许,也可以选择更多的刺激因子；(3)几乎实验中都会出现禁食禁水、冰水游泳、潮湿垫料、笼倾斜、光照节律改变,再搭配一些其他刺激因子；(4)建议每天选择1 ～2 种刺激因子；(5)造模长度选择3～4 周比较合适,如果是先造模后给药,可以采用造模与给药时间等同；(6)大小鼠都可以使用糖水偏好实验、旷场实验、强迫游泳实验,如果是小鼠也可以使用悬尾实验,而进行认知与焦虑方面的研究可以考虑水迷宫实验、高架十字迷宫实验。